响应面法优化溶藻弧菌的培养条件

张晓艳，宁喜斌

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

响应面法优化溶藻弧菌的培养条件

张晓艳，宁喜斌*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

通过单因素实验确定pH、温度、盐度三个因素下溶藻弧菌的最优培养条件。根据Box-Behnken中心组合实验原理进行响应面分析，以菌液的OD600为响应值，确定影响溶藻弧菌培养的各因素水平。结果表明，最优培养条件为pH7.62、温度34.55℃、盐度3.22%；菌体生长过程中pH和温度、温度和盐度对V.a ATCC17749生长的交互作用显著。

溶藻弧菌，Box-Behnken，响应面，培养条件

Abstract：According to singe-factor experiments，three levels factors including the pH，temperature and salinity were selected to evaluate the optimum culture condition of Vibrio alginolyticus.Based on Box-Behnken central composite design principle of the Response Surface Methodology（RSM），the OD600was chosen as response value to determine the range of factors and levels.With the results，the optimized conditions of cultivation were as follows：pH7.62，temperature 34.55℃ and salinity 3.22% ，respectively.During the germination significant interactions between pH and temperature，as well as temperature and salinity were found.

Key words：Vibrio alginolyticus；Box-Behnken；response surface methodology（RSM）；culture condition

溶藻弧菌存在于多种海洋动物体内及海域水体中，是鱼、虾、贝类等海水养殖动物的致病菌[1-3]。其致病性大多发生在夏季，另外动物体免疫机能下降或者环境条件恶化时也容易发生[4]，同时，溶藻弧菌为人和水生动物共患的病原菌，可以引起食物中毒、败血症及中耳炎等[5]。近几年来，国内不少地方也不断报道了关于溶藻弧菌引起食物中毒的事件。2004年7月24日赤峰市某酒店发生了一起集体共同食用未经煮熟煮透的盐水虾而引起的溶藻弧菌中毒事件[6]；2006年，龙潭区某村17名村民发生胃肠道疾病，经现场卫生学和流行病学调查，结合实验室检测结果，证实了是一起溶藻弧菌引起的食物中毒事件[7]。本文以溶藻弧菌标准菌株V.a ATCC17749为研究对象，测定pH、温度、盐度三个因素下改菌的生长变化，应用Box-Behnken实验设计原理进行响应面分析，得到该菌的最合适的培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 溶藻弧菌标准菌株V.a ATCC17749；革兰氏阴性杆菌增菌液 杭州天和微生物试剂有线公司；蛋白胨、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、营养肉汤、副溶血性弧菌增菌液、GN增菌液 上海市疾病预防控制中心。

台式pH精密测试仪 德国WTW；UV2300分光光度计 上海天美科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基优化实验 营养肉汤、GN、TSB、碱性蛋白胨水及副溶血性弧菌增菌液各100mL，分装于11支试管中灭菌，取一环培养10h后的V.a接种，37℃培养，每隔1h测定OD600。

1.2.2 菌体生长的测定 V.a培养10h后，根据1.2.1实验结果选取最优培养基，取一环接种于5mL含3%NaCl的该培养基中，做2组平行，培养后在600nm处测定其吸光值。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同pH对V.a生长的影响 以HCl或NaOH溶液将5mL的含3%NaCl的优选培养基的pH分别调为5.00、6.00、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、9.50和10.00。取一环V.a接种后37℃培养，每间隔1h取样，连续取样11次，600nm下测吸光度，优选适合V.a生长的pH的范围。

1.2.3.2 不同温度（T）对V.a生长的影响 取一环V.a接种于5mL的含3%NaCl的优选培养基中，分别在15、20、25、30、35、37、40、45℃下培养，每隔1h取样，连续取样11次，600nm下测吸光度，优选适合V.a生长的温度范围。

1.2.3.4 不同盐度（S）对V.a生长的影响 优选培养基中添加不同量NaCl，使其最终盐浓度达到1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%。取一环V.a接种后37℃下培养，每隔1h取样，连续取样11次，600nm下测吸光度，优选适合V.a生长的盐度范围。

1.2.4 响应面实验 通过对影响V.a生长的单因素分析，确定在单因素条件下适合V.a生长的pH、温度及盐度范围，再用3因素3水平的响应面分析，优化其生长条件，以溶藻弧菌OD600为响应值（R），实验因素与水平设计见表1，并在此最佳生长条件下，测定培养8h后的OD600，平行做3次验证实验，证实响应面分析方法的可靠性。

表1 响应面三因素三水平实验设计Table 1 Experiment design of 3 factors and 3 levels of response surface method

2 结果与分析

2.1 培养基的优化选择

V.a ATCC17749在5种不同增菌液中的生长趋势见图1。其中在碱性蛋白胨水中基本不生长，在营养肉汤、GN及副溶血性弧菌增菌液中生长缓慢，在GN增菌液中10h后OD600值才大于1.0，在TSB中生长速度较快，延滞期最短，培养5h左右OD600即大于1.00。因此在单因素实验中均采用TSB。

图1 不同培养基对V.a ATCC17749生长的影响Fig.1 Growth of V.a ATCC17749 in different medias

2.2 不同条件下培养V.a的单因素实验

2.2.1 pH对V.a生长的影响 如图2所示，在pH为5.0和10.0时，V.a基本不生长，在pH为6.0、9.0和9.5时，V.a生长缓慢，在pH 7.0～8.5时，V.a生长较快，6h时OD600均大于1.0，因此，pH7.0～8.5为V.a最适生长条件。

2.2.2 温度（T）对V.a生长的影响 在不同温度条件下V.a的生长结果见图3。V.a在15、45℃条件下基本不生长，在20、25℃时生长缓慢且延滞期较长，在7h后进入对数期，温度在30～40℃时，V.a生长较快，30℃延滞期为4h，35、37℃延滞期为3h，40℃延滞期缩短为2h，但是40℃在5h后进入稳定期。因此，选择温度30～37℃为V.a最适生长条件。

图2 pH对V.a ATCC17749生长的影响Fig.2 Effect of the pH on growth of V.a ATCC17749

图3 温度对V.a ATCC17749生长的影响Fig.3 Effect of the temperature on growth of V.a ATCC17749

2.2.3 盐度（S）对V.a生长的影响 在不同盐度条件下V.a的生长结果见图4。盐度7%～10%时，V.a基本不生长，盐度6%时生长比较缓慢，盐度1%～5%时适宜V.a的生长，但在2%～4%盐度下延滞期较短。因此，选择盐度2%～4%为V.a最适生长条件。

图4 盐度对V.a ATCC17749生长的影响Fig.4 Effect of the salinity on growth of V.a ATCC17749

2.3 响应面实验

2.3.1 Box-Behnken交互实验方案及实验结果 实验分析方案及结果见表2。从中可以看出预测值与实测值比较接近，偏差小于6.36%，表明本实验因素水平取值比较适当。

采用Design-Expert软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程：Y=1.58+0.019A+0.045B+0.011C+0.038AB+0.010AC+0.052BC-0.058A2-0.11B2-0.068C2

回归模型方差分析见表3，OD600曲面模型是极显著的（p=0.0071＜0.01）；温度对菌生长影响显著（p＜0.05），同时复相关系数R2＝0.9067，说明因素选择合理，该模型能够解释90.67%的变化。

2.3.2 菌体生长条件的优化 利用Design-Expert软件处理得所得响应面分析结果图5～图7。等高线的形状反映交互效应的强弱，圆形表示两个因素交互作用不显著，椭圆形表示两个因素交互作用显著。从图5、图7可看出，pH和温度以及温度和盐度对V.a ATCC17749生长的交互作用显著。利用Design-Expert软件，3个因素的最优实验点（A、B、C）代码值（0.243、0.300、0.221）即（7.62、34.55℃、3.22%），此时OD600取最大值1.588。

表2 分析方案及结果Table 2 Experimental results and scheme of response surface method

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

2.3.4 验证实验 以2.3.3确定的最优条件将V.a ATCC17749及海水、贻贝、大黄鱼中分离的经验证是溶藻弧菌的菌株W1，SH1，F1，F2培养8h，测OD600，做3次平行实验并取平均值，见表4。其中V.a ATCC17749验证预测最佳条件实测值与预测值偏差为1.70%，证实响应面方法可靠，其他溶藻弧菌菌株与标准菌株有一定的差异性，在此条件虽与预测值有一定的偏差，但其OD600均达到了较大的值。

图5 pH和温度交互作用对V.a ATCC17749生长的影响Fig.5 Effect of interaction between the temperature and pH on growth of V.a ATCC17749

图6 pH和盐度交互作用对V.a ATCC17749生长的影响Fig.6 Effect of interaction between the pH and salinity on growth of V.a ATCC17749

图7 温度和盐度交互作用对V.a ATCC17749生长的影响Fig.7 Effect of interaction between the temperature and salinity on growth of V.a ATCC17749

表4 实验结果的验证Table 4 Results of demonstration tests

3 结论与讨论

通过单因素分析，溶藻弧菌最适生长条件为pH7.0～8.5，温度30～37℃，盐度1～5%。在此基础上采用响应面的方法综合考虑pH、温度和盐度三个因素对菌体生长的影响。根据Box-Behnken中心组合设计原理设计了三因素三水平实验，用Design-Expert软件处理实验数据，实验结果表明，V.a ATCC17749的最优培养条件为：pH7.62、温度34.55℃和盐度3.22%；菌体生长过程中，pH和温度以及温度和盐度对V.a ATCC17749生长的交互作用显著。虽然溶藻弧菌不同菌株的最佳生长条件会有所差异，但是优化的V.a ATCC17749生长条件对其他菌株也有一定参考价值。

[1]潘晓艺，沈锦玉，尹文林，等.水生动物的弧菌病及其致病机理[J].大连水产学院学报，2006，21（3）：272-277.

[2]Lee K K，Liu P C，Chen Y C，et al.The implication of ambient temperature with the outbreak of vibriosis in cultured small abalone Haliotis diversicolor supertexta Lischke[J].Journal of Thermal Biology，2001，26：585-587.

[3]温崇庆，薛明，何红，等.两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定[J].微生物学通报，2008，35（3）：346-352.

[4]Carlos R，Aliciae E，Juan L B，et a1．Association of Aeromonas hydrophila and Vibrio alginolyticus with Larval Mortalities of Scallop（Argopeeten Purpuratus）[J].Journal of Invertebrate Pathology，1996，67：213-218.

[5]Ardic N，Ozyurt M.Case report：Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Microbiology Bul，2004，38：145-148.

[6]邢素琴，侯颖晖.一起溶藻弧菌一起食物中毒的实验室监测分析[J].医学动物防制，2006，22（2）：130-131.

[7]李刚，赵军.一起由溶藻弧菌引起的食物中毒调查[J].中国热带医学，2008，8（3）：519-520.

Optimization of cultivation conditions of vibrio alginolyticus by response surface methodology

ZHANG Xiao-yan，NING Xi-bin*
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 210306，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0221-04

2011－12－21 *通讯联系人

张晓艳（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全。

上海市科委工程中心建设（11DZ2280300）；上海市教育委员会重点学科建设项目资助（J50704）。