结核分枝杆菌复合群检测在AIDS合并结核病诊断中的应用

杨绍敏，樊移山，李惠琴，高 丽，杨壁珲，张 米，李正伦，周曾全

(云南省传染病专科医院艾滋病关爱中心检验科，云南 昆明 650301)

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)合并结核病时由于免疫缺陷导致常规抗酸染色阳性率低[1-2]、结核菌素试验无反应[3]、临床结核中毒表现不典型[4-5]、结核分枝杆菌培养时间较长。临床诊疗迫切需要实验室提供早期、特异的病原学诊断信息。我们探讨了结核分枝杆菌转录酶主导基因扩增法(TMA)直接扩增结核分枝杆菌复合群(MTD)RNA在AIDS合并结核病患者实验诊断的临床应用。

材料和方法

一、研究对象

具有以下入组标准1条以上症状者即可入组。(1)持续发热在38℃左右超过2周者;(2)频繁咳嗽或阵发性咳嗽、咳痰超过3周者;(3)咳血或伴有血痰者;(4)有盗汗者;(5)有咽痛、胸痛超过2周者;(6)胸腔积液，胸部X线检查异常者;(7)头痛伴或不伴呕吐、意识障碍者;(8)淋巴结明显红、肿、痛并持续发热超过2周者;(9)胸、腹水原因不明并持续发热超过2周者。2009年7月至2010年6月共入组152例疑似结核病待诊患者。其中AIDS患者127例，男84例，女43例，年龄8～74岁。由云南省艾滋病关爱中心艾滋病确证实验室采用免疫印迹法(WB)确证。对照组25例，男18例，女7例，年龄18～77岁，为同期内科住院和门诊非人类免疫缺陷病毒(HIV)感染但临床疑似结核病待诊患者。

二、样本种类

经培训的医护人员规范采集临床样本[6]，AIDS组127例样本均为痰液，对照组25例样本中有3例灌洗液、3例术后痰、1例支气管刷落物。

三、仪器和试剂

1.美国GEN-PROBE LEADER 50i化学发光检测仪;水浴超声震荡仪;95、60和42℃干浴孵育器;MTD检测试剂盒(Amplified MTD)。

2.法国梅里埃公司的BacT/ALERT 3D 360全自动培养仪，结核菌培养温度设置为(35±1)℃，时间设定为42 d。配套的BacT/ALERT MP结核分枝杆菌培养瓶和复溶液[6]。

3.达安基因公司DA 7600聚合酶链反应(PCR)扩增仪及配套TB-DNA PCR试验盒。

四、方法

1.样本处理 痰样本用 N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)进行前处理[6-7]。处理后的样本分为3份，在沉淀物中加入1～2 mL牛白蛋白溶液混匀，取50 μL裂解液于裂解试管中，加入经前消化处理的样本450 μL，混匀后置于水浴超声震荡器中15～20 min裂解细菌释放rRNA用于MTD检测，同样方法裂解阳性、阴性质控物;取1 mL加入3D结核瓶进行结核分枝杆菌培养，仪器报阳即进行涂片萋-尼抗酸染色镜检及TB-DNA PCR 检测[1，6];前处理的样本最后进行涂片萋-尼抗酸染色镜检。支气管灌洗物等样本置于50 mL离心管，1200×g离心15 min，弃上清，沉淀物加入pH值为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)0.9 mL，同样方法处理。

2.MTD检测 该法采用特有的等温酶通过DNA中间体直接扩增rRNA靶基因，操作严格按照试剂盒说明书进行。取样本裂解产物、阳性和阴性质控物各25 μL分别加入预置有扩增试剂50 μL及甘油200 μL的扩增管内，95℃干浴15 min、42℃ 5 min，加入25 μL等温酶试剂混匀后继续扩增30 min，加入100 μL杂交试剂混匀，60℃杂交15 min;加入300 μL筛选试剂混匀60℃15 min，取出置室温 5 min后，在 1 h内用LEADER 50i化学发光检测仪检测样本相对发光值(relative light units，RLUs)，样本被检测的同时rRNA也被淬灭。结果判断:RLUs≥500000阳性，RLUs＜30000阴性，30000～499999 RLUs可能为MTD，重复试验以验证结果(重复试验RLUs≥30000即可判为阳性)。要求同批检测的阳性质控RLUs≥1000000，阴性质控RLUs＜20000时实验成立[8-11]。

五、统计学方法

用SPSS PASW 17.0统计软件中，分别采用配对χ2检验和Fisher确切概率法对各组阳性检出率进行统计学分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、临床特征

AIDS组患者临床表现咳嗽81.9%(104/127)，发热 81.1%(103/127)，咳痰 47.2%(60/127)，消瘦 37.8%(48/127)，呼吸困难18.9%(24/127)，头痛 6.3%(8/127)，胸痛4.7%(6/127)，血痰、皮疹、淋巴结肿痛各占3.9%(各 5/127)。发热咳嗽的103例患者中鹅口疮18例(14.2%)，合并肺孢子菌肺炎(PCP)9例(7.1%)，合并隐球菌感染1 例(0.8%)。

对照组患者咳痰、咳嗽各占88.0%(22/25)，发热。消瘦各占32.0%(8/25)，血痰16.0%(4/25)，胸痛 12.0%(3/25)，呼吸困难 8.0%(2/25)。

二、MTD的符合率

127例AIDS患者中有32例结核分枝杆菌培养阳性且PCR鉴定为结核分枝杆菌，MTD均为阳性;25例对照者中有11例结核分枝杆菌培养阳性且PCR鉴定为结核分枝杆菌，MTD均为阳性，符合率为100.0%(43/43)。

三、3种方法阳性率比较

对MTD、结核分枝杆菌培养和抗酸染色3种方法对AIDS组、对照组的临床样本检出阳性率进行比较，差异均无统计学意义=3.670，P ＞0.05=0.113，P ＞0.05)。对 2 组不同方法进行比较，MTD、结核分枝杆菌培养检出率在AIDS和对照组之间差异无统计学意义;与抗酸染色阳性率差异有统计学意义(χ2=5.357，P＜0.05)，在AIDS组抗酸染色阳性率最低，见表1。

表1 AIDS组与对照组3种方法阳性检出率比较 [例(%)]

四、其他病原菌检出情况

127例AIDS患者在进行结核分枝杆菌培养过程中培养出其他细菌，经鉴定为非结核分枝杆菌占 9.5%(12/127)、马尼菲青霉 1.6%(2/127)、马红球菌1.6%(2/127)、隐球菌 0.8%(1/127)，25例对照者中未检出非结核分枝杆菌和真菌。

讨 论

结核分枝杆菌是AIDS最常见的机会性感染，也是致死的主要原因[3]。免疫缺陷致使结核分枝杆菌双重感染的临床表现呈多系统播散和多个脏器病变，其症状、体征和影像学的表现复杂而不典型，结核病的发热、盗汗、消瘦、乏力、咳嗽等症状也常被AIDS合并其他机会性感染所掩盖，失去了结核病原有的症状特征和诊断意义[6，12]。因此，病原学的诊断对临床诊疗非常重要。本研究结果显示127例AIDS患者中经培养鉴定仅有25.2%(32/127)为 AIDS合并结核分枝杆菌感染。而合并鹅口疮者占14.2%(18/127)、PCP 7.1%(9/127)，合并隐球菌感染 0.8%(1/127)，非结核分枝杆菌感染9.5%(12/127)、马尼菲青霉感染 1.6%(2/127)。

MTD是采用等温酶法扩增MTD rRNA，然后用一个吖啶酯标记的核酸探针与之杂交，再经杂交保护分析法筛选，最后以化学发光仪检测被标记的rRNA[8-11]。由于同一条细菌rRNA片段的含量是DNA片段的数百至数千倍，故同一样本扩增rRNA的敏感性将大大增加，尤其对于含菌量较少的样本，MTD法能充分显示出其敏感性高的优点。O'Sullivan等[11]报道了 1998年 2月至2001年10月，采用MTD方法检测呼吸道样本391份、非呼吸道样本164份的结果，与结核诊断的“金标准”培养方法比较，敏感性及特异性分别为91.2%和93.9%。国外加拿大公共卫生中心采用MTD诊断结核性脑膜炎，敏感性及特异性为93.8% 及99.3%。国内重庆胸科医院采用MTD诊断结核病的敏感性为50.7%(34/67)，特异性为96.9%(32/33)，与广州胸科医院的结果相同[13]。但都是用于普通结核病的诊断，目前尚无AIDS合并结核分枝杆菌诊断的报道。

由于rRNA仅存在于活的生物体内，故MTD阳性具有结核分枝杆菌活菌诊断价值。由于rRNA为单链结构，脆弱易降解，故不易造成环境污染。相比之下DNA为双链结构，稳定、不易降解，故容易造成环境污染及假阳性结果。

本组研究中同时采用3种方法，对AIDS合并疑似结核分枝杆菌感染和非HIV感染的单纯结核待诊患者进行检测，单纯结核对照组进行结核分枝杆菌检测的阳性率基本一致，而AIDS组的阳性检出率相差较大，抗酸染色阳性率明显低于对照组，符合AIDS患者免疫缺陷导致抗酸染色阳性率偏低的特征[1]。Karstaedt等[14]1998 年报道，经培养确诊的421例成人肺结核患者中，HIV阴性的227例其涂阳率为79.0%，而HIV阳性的185例其涂阳率只有68.0%，2组差异有统计学意义。痰检阳性率降低的原因可能与被吞噬于巨细胞内的结核分枝杆菌抗酸性减弱或消失，致使常规抗酸染色不易检出有关。HIV感染者如怀疑合并结核病，痰、组织液或分泌物中找不到结核分枝杆菌，需做结核分枝杆菌培养或MTD检测以明确诊断。

结核分枝杆菌培养由于AIDS患者合并细菌、真菌等机会性感染易导致假阳性，并且培养时间相对较长;而采用MTD可以弥补培养法和抗酸染色法的缺陷，阳性检出率较高。

AIDS组抗酸染色的阳性率不仅低于培养法和MTD，而且单纯涂片抗酸染色不能区分结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和马红球菌。本组资料中有2例是马红球菌感染，而马红球菌抗酸染色呈弱阳性，若是菌含量高，在抗酸染色中依然可以报告4+、3+、2+、1+等结果。而这种情况我们只有结合TB-DNA PCR、MTD及细菌鉴定才可以排除结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌的感染。

需要注意的是，在AIDS组有很大一部分是非结核分枝杆菌感染[9.5%(12/127)]。由本研究也可以看出，在AIDS患者中出现发热、咳嗽、咳痰等结核病症状时，并不能排除非结核病的可能，而是应该将非结核感染纳入考虑之一。

本组资料表明，同时采用3种方法对AIDS合并结核病的病原学诊断提供了早期、特异的试验数据，为临床明确诊断、确定抗结核治疗方案提供了及时有效的信息。由于MTD只能检出活菌，为了排除样本采集之后保存不当、非结核分枝杆菌感染或其他抑制物会导致的假阴性或假阳性结果，建议与培养、涂片进行平行检测。

MTD是一种快速、敏感而特异的诊断结核病新的分子生物学检测方法[15]，虽然MTD试剂价格较高，但可在1个工作日内得到特异的病原学诊断，为明确治疗方案有着非常重要的应用价值。通过早诊断、早治疗、规律、联合全程抗结核治疗，可降低医疗费用，节省整体治疗和防治计划的成本。明确的病原学诊断对有效的抗结核治疗、降低AIDS合并结核病患者的死亡率都将产生积极的作用。

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