卵黄高磷蛋白的纯化及其对RAW264.7生长形态的影响

吕瑜峰，王亮，张佳慧，帖航，孙佩佩，吴子健

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

卵黄高磷蛋白（phosvitin，PVS）是蛋黄中主要的磷蛋白，约占蛋黄蛋白质的 7%[1]，有 α－PVS（37、42 、45 Ku）和 β－PVS（45 Ku）两种，其中 β－PVS 含量较 α－PVS多[2]。PVS具有独特的物化特性，其分子中磷的含量约10%，是已知蛋白质中磷酸化程度最高的，主要原因在于其分子中约50%的氨基酸残基是丝氨酸残基，且90%丝氨酸残基被磷酸化[3]。正是由于其高度磷酸化性质，使其具有很强的乳化性、抗氧化性、杀菌性以及金属离子螯合力（蛋黄中所含的约95%的铁离子与其结合）[4]。

目前PVS的分离纯化大致可分为两步，先是从蛋黄中分离出PVS粗品，然后采用层析技术进一步纯化。然而，现有的方法常使用非食品级的有机溶剂来实现PVS与脂质的分离，会改变PVS结构，且不适合在食品工业上的应用[1－7]。Castellani等采用 Mg2+来沉淀 PVS，虽然未用有机溶剂，但提取过程过于繁琐且耗时[8]。近来，Ko等[9]利用乙醇和钠盐建立了一种可以大规模提取PVS的方法，其回收率可达到97%，但所得产品纯度不高。本文旨在采用阴离子交换层析提高PVS产品的纯度并进一步研究其对RAW264.7细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

鸡蛋：市售；1－氨基－2萘酚－4－磺酸：沃凯；Coomassie R250：sigma；SDS－PAGE标准品：Fermentas；Q SepharoseTMFastFlow强阴离子交换树脂：GEHealthcare；小鼠巨噬细胞RAW264.7:中科院上海细胞库；胎牛血清:GBICO；DMEM培养基:Hyclone；其它试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

UDK－159全自动凯氏定氮仪：意大利VELP公司；WFZ800－D3B紫外可见光分光光度计：北京瑞利；CXG－1电脑恒温层析柜：上海沪西；PowerPacTMUniversal电泳仪电源：美国BIO－RAD；3－18K离心机：德国sigma；NIKON eclipse TS100—F倒置成像显微镜：日本；Heraeus HERAcell 240i二氧化碳培养箱：美国。

1.3 方法

1.3.1 PVS的分离

PVS制备采用Ko的方法[9]，略改进，具体如下：鲜蛋黄100 g加2倍体积水于4℃下搅拌30 min，然后离心30 min（4 000 g、4℃）；所得沉淀加入4倍体积85%的乙醇后均质2 min（3 000 r/min），再离心10 min（4 000 g、4℃），重复此脱脂过程3次；所得脱脂沉淀用9倍体积10%的NaCl溶液浸提，并调pH至4.0，于 4 ℃下搅拌 30 min后离心30 min（4 000 g、4℃），上清再经透析、冻干即得PVS粗品（PVi）。

1.3.2 PVS的纯化

Q Sepharose FF（QSFF）离子交换层析（φ1.0 cm×10 cm，填充高度8 cm）纯化PVS。平衡缓冲液为NaAc/HAc（20 mmol/L、pH 5.0、0.3 mol/L NaCl），样品溶于平衡缓冲液中，上样体积3 mL（10 mg/mL），采用0.4 mol/L～0.6 mol/L NaCl的浓度梯度进行分步洗脱，流速1 mL/min。

1.3.3 氮、磷含量的测定

凯氏定氮法测定氮含量和蛋白质含量；磷含量测定采用钼蓝法[10－11]。

1.3.4 SDS－PAGE电泳[9]

1.3.5 PVS回收率和纯度测定

按Ko的方法测定PVS的回收率[9]，纯度采用N/P摩尔比来衡量，其值越小表明纯度越高[12]。

1.3.6 PVS对RAW246.7细胞的影响

RAW264.7按ATCC方法培养[13]。取对数期细胞接种于96孔培养板，加入终浓度为10、100、800 μg/mL的PVS，对照组为卵清白蛋白（OVA）或牛血清白蛋白（BSA）。培养24 h，于倒置显微镜下观察细胞形态（200×）。

2 结果与分析

2.1 纯化PVS的结果

QSFF离子交换层析分离纯化PVi，其中用0.3、0.5、0.6 mol/L NaCl溶液洗脱时分别得到3个组分（即A、B和C组分），层析图谱为图1，而0.4 mol/L NaCl洗脱时，流出液无紫外吸收变化（数据未显示）。A组分为穿透峰，其蛋白质N/P摩尔比8.2（表1），经电泳检测（图2）该组分含分子量较高的HDL和分子量较低的蛋白，且低分子量蛋白组分中含有α1－PVS；图1还显示B组分为主要的蛋白组分；组分C相对含量很少；合并组分B和C并经电泳检测（图2）表明其含有β－PVS、α1－PVS 和 α2－PVS 3 种 PVS，几乎没有杂蛋白，即得到纯化的 PVS（PVp）。

表1 PVS蛋白质检测结果比较Table1 ComparingmeasurementresultsofobtainedPVStoKo′s

检测得到的PVS的蛋白质含量及其N/P比以及本工艺的蛋白回收率，并与Ko等的方法得到的结果（PVSKo）进行比较。比较结果由表1可知，PVi产品回收率与PVSKo相近，但蛋白质含量却远低于PVSKo。PVi其N/P摩尔比为4.40，约为sigma标准品N/P（2.49）的1.8倍；但经纯化后，PVp的N/P摩尔比为2.78，回收率57.60%，蛋白质含量也大幅提高（85.66%）。再同其他国内外学者的分离提取该蛋白的结果相比较：张小伟[14]等采用PEG来提取PVS后经QSFF纯化，回收率仅为47%；而Castellani采用DEAE离子交换柱仅回收了42.5%的PVS，尽管纯度很高（98%）；Bo Lei等将蛋黄做简单处理后直接利用离子交换层析提取PVS，其产物的N/P摩尔比为2.44，但回收率仅为35.4%[15]。因此本工艺兼顾了PVS的纯度和回收率（表1）。

2.2 PVS对RAW246.7细胞的影响

单核/巨噬细胞遍布于机体并在第一时间识别外源性物质，即能发挥先天免疫作用，也是连接先天免疫防御和获得性免疫应答的重要枢纽[16]。RAW264.7是源于小鼠的巨噬细胞系，在无抗原刺激的静息状态下呈体积较小的类圆形；但当受到外源刺激时，其体积会变大，伸出大量伪足，伴有炎症反应，见图3。

图3表明，随着BSA和OVA浓度的增加，RAW264.7细胞的形态发生剧烈变化，几乎所有的细胞被活化；但是，PVS组即便是在800 μg/mL的高浓度下，绝大多数细胞的形态仍处于静息状态。形学观察表明，PVS可维持RAW264.7细胞处于静息状态，不会引起细胞向炎症巨噬细胞形态的转变。

3 结论

1）QSFF阴离子交换层析纯化PVS的条件：平衡缓冲液为 NaAc/HAc（20 mmol/L、pH 5.0 、0.3 mol/L NaCl）、0.3 mol/L～0.6 mol/L NaCl不连续分步洗脱；终产品（PVp）N/P摩尔比为 2.78，回收率 57.6%，蛋白质含量85.66%。

2）在考察剂量范围内，PVS未引起RAW264.7细胞的细胞培养形态向炎症巨噬细胞形态的转变。

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[1]Mecham D K,H S Olcott Phosvitin.The principal phosphoprotein[J].Am Chem Soc,1949,71(11):3670－3679

[2]Abe Y,T Itoh,S Adachi.Fractionation and characterization of hen′s egg yolk phosvitin[J].Food Sci,1982,47(6):1903－1907

[3]Clark R C.The primary structure of avian phosvitins.Contributions through the Edman degradation of methylmercaptovitins prepared from the constituent phosphoproteins[J].The international journal of biochemistry,1985,17(9):983－988

[4]Grogan J,Taborsky G.Iron binding by phosvitin:variation of rate of iron release as a function of the degree of saturation of iron binding sites[J].Journal of inorganic biochemistry,1986,26(4):237－246

[5]Wallace R A,Morgan J P.Chromatographic resolution of chicken phosvitin,Multiple macromolecular species in a classic vitellogeninderived phosphoprotein[J].The biochemicaljournal,1986,240(3):871－878

[6]Losso J N,Bogumil R,Nakai S.Comparative studies of phosvitin from chicken and salmon egg yolk[J].Comparative biochemistry and physiology B,Comparative biochemistry,1993,106(4):919－923

[7]Choi I,Jung C.Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailability of calcium and its accumulation in bones[J].Food chemistry,2005,93(4):577－583

[8]Castellani O,Martinet V,David－Briand E,et al.Egg yolk phosvitin:preparation of metal－free purified protein by fast protein liquid chromatography using aqueous solvents[J].Journal of chromatography B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences,2003,791(1/2):273－284

[9]Ko K Y,Nam K C,Jo C,et al.A simple and efficient method for preparing partially purified phosvitin from egg yolk using ethanol and salts[J].Poultry science,2011,90(5):1096－1104

[10]陈庆森,庞广昌,吴子健.实用生物化学实验技术指导[M].天津:天津科学技术出版社,2006:83－85

[11]Bartlett G L.Phosphorus assay in column chromatography[J].Biol Chem,1959,234:466－468

[12]R W Burley,W H Cook.Isolation and composition of avian egg yolk granules and their constituent α－ and β－lipovitellins[J].Canadian journal of biochemistry and physiology,1961,39(8):1295－1307

[13]ATCC.Product Details[S/OL].http://www.atcc.org/ATCCA dvanced CatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=TIB－71&Template=cellBiolog

[14]Zhang X,Qiu N,Geng F.Simply and effectively preparing high－purity phosvitin using polyethylene glycol and anion－ exchange chromatography[J].Journalofseparationscience,2011,34(22):3295－3301[15]Lei B,Wu J.Purification of egg yolk phosvitin by anion exchange chromatography[J].Journal ofchromatographya,2012,1223(0):41－46

[16]HumeDA.Themononuclearphagocytesystem[J].CurrOpin Immunol,2006,18(1):49－53