病理性疼痛和脾切除手术对老年雄性大鼠海马细胞胆碱乙酰转移酶和细胞凋亡的不同影响

朱雅斌，孙灿林，谢国柱，钱涛，姜琳

(泰州市人民医院麻醉科，江苏泰州225300)

病理性疼痛和脾切除手术对老年雄性大鼠海马细胞胆碱乙酰转移酶和细胞凋亡的不同影响

朱雅斌，孙灿林，谢国柱，钱涛，姜琳

(泰州市人民医院麻醉科，江苏泰州225300)

目的探讨病理性疼痛和脾切除术对老年雄性大鼠海马细胞胆碱乙酰转移酶和细胞凋亡的不同影响及其机理。方法选择60只老年雄性大鼠，随机分为3组，A组单纯麻醉，只给予麻醉处理(单纯麻醉组)；B组在左侧大腿中部切开，暴露坐骨神经后用4-0丝线结扎4道，常规缝合皮肤(CCI组)；C组给予脾切除手术之后常规缝合伤口(脾切除组)。三组再按术前1 d、术后1 d、7 d、14 d 4个时间点，将每组再分为4个小组(n=5)。分别为：A1、A2、A3、A4，B1、B2、B3、B4，C1、C2、C3、C4，在术前1 d和术后1 d、7 d、14 d按时间点经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸经升主动脉依次灌注生理盐水100 ml和4%多聚甲醛-PBS复合液300 ml后，开颅取脑，石蜡切片后分别进行HE和CHAT免疫组化染色，光镜下观察海马组织细胞形态变化。结果HE染色显示CCI组锥体层细胞损伤重，有较多凋亡形态细胞出现，高峰在术后14 d，脾切除组锥体层和颗粒层均有损伤，出现细胞减少，形态改变；CHAT免疫组化染色3组均有CHAT阳性细胞数的减少，术后7 d、14 d CCI组较脾切除组染色明显偏浅。结论病理性疼痛和脾切除组造成海马细胞损伤的位置和程度不同，可能存在不同的机制。

疼痛；脾切除；胆碱乙酰转移酶；细胞凋亡

手术刺激是造成术后患者认知功能障碍的重要因素，大脑海马细胞在认知中扮演着重要角色，认知功能障碍与海马突触可塑性改变密切相关，包括突触结构和功能的可塑性[1]，因此海马的损伤是衡量认知功能障碍的重要指标。但是，由于手术种类繁多，各类手术刺激造成的海马细胞凋亡机制是否均相同目前尚不清楚。本课题选取坐骨神经慢性压迫(CCI)疼痛模型和脾切除模型造成雄性老龄大鼠认知障碍，观察两种手术类型造成海马细胞凋亡的表像是否相同并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料选用18～20个月龄的SD大鼠经筛选剔除体重过大或过轻及在水中不游动者，共选出动物60只，体重450～500 g。参照随机数字表，60只大鼠随机分为3组，样本量根据统计学估算得出。A组：单纯麻醉组；B组：CCI组；C组：脾切除组。各组再根据术前1 d、术后1 d、7 d、14 d 4个时间点再分为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4共12个组。

1.2 实验方法建立模型前均采用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，局部消毒。A组给予麻醉处理，常规喂养，仅作对照；B组采用Bennett等[2]的方法于大鼠左侧大腿中部切开，暴露坐骨神经，在其分叉处用4-0丝线间隔1 mm松扎4道，逐层缝合；C组大鼠行脾切除术，之后以1#丝线关腹。手术伤口均常规覆以青霉素粉末，术后未有感染发生。造模之后1 d、7 d、14 d予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，先经左心室向升主动脉注射肝素0.l ml抗凝，再依次灌入生理盐水(4℃)约100 ml、PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)300 ml；然后开颅取脑，剥离海马，标本在PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)中浸泡48 h。各组动物取左侧脑组织石蜡包埋切片。以能切取的海马最大面为中心，行5 μm连续冠状面切片，每只鼠取4张切片。取间隔的两张做HE染色观察大体变化；右侧脑组织行30 μm连续冠状面切片，取两张片做胆碱乙酰转移酶(CHAT)免疫组化。

1.3 统计学方法采用SPSS11.5统计学软件，方法采取完全随机设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠海马CA3区锥体细胞HE染色HE染色显示，CCI组和脾切除组在术后1 d、7 d、14 d均有明显的细胞数减少，和A1组比较，B组1 d、7 d、 14 d和C组1 d、7 d、14 d均有明显细胞数减少(P＜0.05)，B组术后14 d和术后1 d相比减少明显(P＜0.05)，见表1。

表1 三组大鼠海马CA3区锥体细胞HE染色40×10倍镜下计数(个，n=5,)

表1 三组大鼠海马CA3区锥体细胞HE染色40×10倍镜下计数(个，n=5,)

注：和A1组比较，#P＜0.05；和A1组比较，*P＜0.05；和A1组比较，△P＜0.05；和A3、A4组比较，◆P＜0.05；和B2组比较，*◆P＜0.05。

组别细胞数组别细胞数组别细胞数A1组A2组A3组A4组58.60±2.51 50.60±3.58#51.80±6.06 48.60±4.15 B1组B2组B3组B4组59.80±3.27 50.80±5.07*45.60±5.13*34.80±6.65*◆C1组C2组C3组C4组60.40±3.21 45.60±6.80△49.80±4.92△48.00±5.83

2.2 三组大鼠海马细胞CHAT免疫组化染色阳性细胞数比较单纯麻醉组CHAT含量没有明显减少，CCI组术后1 d、7 d、14 d逐渐减少，术后1 d、7 d、14 d CHAT阳性细胞数均少于A1组(P＜0.05)，脾切除组术后1 d CHAT阳性细胞数最少(P＜0.05)，术后7 d、14 d逐渐恢复，见表2。

表2 三组大鼠海马细胞CHAT免疫组化染色阳性细胞数(个，n=5,)

表2 三组大鼠海马细胞CHAT免疫组化染色阳性细胞数(个，n=5,)

注：和A1组比较，#P＜0.05。

A1组A2组A3组A3组59.20±3.27 44.40±5.86#50.00±7.91 54.40±5.41 57.60±6.58 53.00±8.03 59.80±3.70 57.80±5.54 B1组B2组B3组B4组59.00±2.92 50.00±5.61 44.80±8.07#36.80±6.30#C1组C2组C3组C4组

2.3 HE染色结果染色显示CCI组和脾切除组术后14 d海马细胞出现较明显的细胞数量减少，且多数细胞核深染明显减少，见图1。

图1 术后14 d HE染色结果

2.4 术后14 d胆碱乙酰转移酶(CHAT)免疫组化染色结果CHAT免疫组化染色显示CCI组和脾切除组术后14 d CHAT阳性细胞数量明显减少，且B组减少更明显，说明海马区胆碱乙酰转移酶数量明显减少，见图2。

图2 术后14 d胆碱乙酰转移酶(CHAT)免疫组化染色结果

3 讨论

CCI组术后1 d、7 d、14 d的细胞数明显少于术前1 d(P＜0.05)，并且14 d损伤最重，细胞丢失最多。脾切除组术后1 d组可观察到细胞减少，和术前相比差异有统计学意义(P＜0.05)，说明脾切除可以造成大鼠大脑海马细胞的减少，但是在术后7 d、14 d细胞数相对稳定,大脑海马细胞损伤较CCI组轻。

HE染色显示，CCI组和脾切除组对于海马细胞的损伤部位有所区别，CCI组主要损伤CA3区锥体层细胞，表现为术后14 d细胞数量减少，层次不清，可见较多凋亡形态细胞，可达60～70个/40×10倍镜，细胞体积普遍缩小、大小不一、形态不规则，胞浆红染，胞核皱缩，轮廓模糊不清，颗粒层细胞基本保持完好。脾切除组对于锥体层和颗粒层细胞均有损伤，并且颗粒层细胞损伤更重，均出现了细胞数量减少，凋亡细胞出现，表现为细胞体积缩小，细胞皱缩，轮廓模糊，锥体层凋亡样细胞有24～38个/40×10倍镜下，颗粒层达到138个/40×10倍镜。足够的锥体层神经元去极化后激活谷氨酸受体NMDA亚型，通道打开，Ca2+离子内流，细胞内Ca2+增加触发一系列反应，引发LTP (长时程增强)促进学习和记忆[1]。CCI组的认知障碍主要是疼痛引起的应激造成海马CA3区锥体神经元细胞萎缩。应激反应促进酸性氨基酸释放，通过间接兴奋齿状回颗粒细胞而损伤CA3区神经元。其次，CA3区锥体细胞缺乏钙结合蛋白D28k和小清蛋白，而齿状回神经元主要是颗粒细胞层则具有钙结合蛋白，钙超载是造成神经细胞损伤的重要原因，钙结合蛋白对神经细胞有一定的保护作用，所以颗粒细胞相对于锥体细胞不容易被损伤，这使得CA3区锥体细胞在应激时更容易被损伤。糖皮质激素在慢性应激中的作用可能是加强酸性氨基酸对CA3锥体细胞的损伤效应[3]。脾切除组对海马细胞锥体层和颗粒层均有损伤有可能是由于脾切除对大鼠神经系统的短期影响更大造成的。

CHAT免疫组化分析表明，CCI模型组从术后1 d开始阳性细胞数开始下降，一直持续到术后14 d，脾切除组术后1 d下降最明显，之后缓慢恢复。乙酰转移酶CHAT是脑内胆碱能系统中的重要的酶类，反映了中枢神经系统乙酰胆碱的活性，乙酰胆碱系统与学习记忆能力关系密切。本次实验证明病理性疼痛比麻醉和脾切除手术对海马细胞的影响强烈并且持续时间长，这可能和神经病理痛的高峰发生在造模后12～14 d有关[4-5]。

由此可见，CCI组和脾切除组造成术后认知功能障碍的机制可能有所不同，除了两者都影响海马细胞CHAT的含量外，病理性疼痛引起大脑海马锥体细胞的凋亡和缺失造成认知障碍，而脾切除手术则同时影响锥体层和颗粒层细胞，造成认知障碍。

[1]陈谊,蔡文玮,盛净.糖尿病模型大鼠认知功能障碍及海马N-甲基-D-天冬氨酸受体表达变化[J].实用医学杂志,2010,26 (17)：3098-3101.

[2]Bennett GJ,Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J]. Pain,1988,33(1)：87-107.

[3]Watanabe Y,Gould E,McEwen BS.Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons[J].Brain Res, 1992,588(2)：341-345.

[4]Blackburn-Munro G,Fleetwood-Walker SM.The sodium channel auxiliary subunits[beta]1 and[beta]2 are differentially expressed in the spinal cord of neuropathic rats[J].Neuroscience,1999,90 (1)：153-164.

[5]Dickinson T,Mitchell R,Robberecht P,Fleetwood-Walker SM.The role of VIP/PACAP receptor subtypes in spinal somatosensory processing in rats with an experimental peripheral mononeuropathy[J]. Neuropharmacology,1999,38(1)：167-180.

Effect of pathological pain and splenectomy on choline acetyltransferase and apoptosis in hippocampus cells of aged male rats.

ZHU Ya-bin,SUN Can-lin,XIE Guo-zhu,QIAN Tao,JIANG Lin.Department of Anesthesiology,Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the different effects of pathological pain and splenectomy on the choline acetyltransferase and the apoptosis in hippocampus cells of aged male rats,and to investigate the mechanisms.Methods Sixty aged male rats were divided into three groups：group A,group B and group C.The rats in group A were treated with anesthesia simply,and those in group B were cut in the middle of the left thigh,and ligated 4 times with 4-0 silk thread after the exposure of sciatic nerve,with the skin sutured routinely then.Rats in group C were given spleen surgery and routine suture of the skin.The three groups were each divided into 4 sub-groups according to different time points(one day before operation,1 day,7 days,14 days after operation),namelyA1,A2,A3,A4,B1,B2,B3,B4,C1,C2,C3,C4,with 5 rats in each sub-group.The rats in each group was anesthetized by 10%chloral hydrate at 4 time points,and then infused by 100 ml saline and 300 ml 4%POM-PBS composite though the ascending aorta.Craniotomied for brain,paraffin sections were carried out after HE and CHAT immunohistochemical staining.The changes of the hippocampus morphology were observed under a light microscope.ResultsIn HE staining revealed that pyramidal layer injured badly in group B,which reached the peak 14 days after the operation,with a lot of apoptotic cells.In group C,pyramidal layer and granular layer were both injured badly,with the number of cells reduced and the cell morphology changed.The number of positive cells reduced in the three groups in CHAT immunohistochemical staining.The dye color of group B was lighter than that in group C 7 days and 14 days after operation.ConclusionThe location and extent of the injury of the hippocampal cells caused by pathological pain and splenectomy were different,with different mechanisms.

Pain;Splenectomy;Choline;Acetyltransferase;Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2012）24—017—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.007

2012-05-08)

朱雅斌(1980—)，男，内蒙古呼和浩特市人，住院医师，硕士。