低氧应激对人肝癌细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表达的影响

吴之浩

（义乌市中心医院 普外一科， 浙江 金华 322000）

低氧是实体瘤局部微环境的特征之一。低氧时，肿瘤细胞发生恶性生物学行为改变：糖酵解途径、增殖、侵袭和转移能力增强，对化疗药物产生耐药性，对放化疗不敏感等[1]。前期研究发现，低氧应激促进人HepG-2细胞黏附、侵袭和迁移[2]。本研究模拟肝癌低氧微环境，探讨低氧应激对人HepG-2细胞甲胎蛋白（AFP）、血管内皮生长因子（VEGF）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1、基质金属蛋白酶（MMP）-9表达的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂 人肝癌细胞株HepG-2引自兰州军区总医院实验科（来源于美国国立肿瘤研究所）， 胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，RT-PCR Kit 购于Takara公司，Trizol为Invitrogen公司产品。MMP-9、TIMP-1、VEGF ELISA试剂盒、AFP放射免疫试剂盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 体外细胞培养及实验分组 HepG-2细胞置灭活10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每3～5天传代一次。低氧组HepG-2细胞置37 ℃、5% O2、5% CO2、90% N2三气培养箱中培养24 h。

1.3 HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表达量的测定 Trizol一步法提取细胞总RNA，电泳见28 s、18 s条带，以2.5μg总RNA为模板，以Takara公司的Random premier为引物进行逆转录反应合成cDNA。根据Genebank中人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin mRNA序列，用primer premier5.0计算机软件设计引物（引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表1）。优化PCR反应条件，分别进行AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9与β-actin共扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像仪摄片，用IamgeMaster Total v1.01软件半定量分析各条带面积，计算各目的基因与内参照β-ac-tin的光密度比值表示各目的基因的mRNA表达量。

表1 人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin引物设计

1.4 HepG-2细胞培养上清AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9含量的测定 取处于对数生长期的HepG-2细胞，按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板，常氧、低氧组HepG-2细胞于常氧、低氧培养24 h；吸取细胞培养上清经1000 r/min离心15 min，取上清；放射免疫测定法测定AFP，酶联免疫吸附法测定VEGF、TIMP-1、MMP-9含量，均严格按试剂盒说明操作。

1.5 统计学处理方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，两样本均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表达 常氧、低氧组总RNA的28 s和18 s条带比值为2:1，表明所提取的总RNA完整性好，可用于RT-PCR实验。图1和表2显示：低氧组AFP、VEGF、MMP-9蛋白及mRNA的表达显著高于常氧组，TIMP-1蛋白及mRNA的表达显著低于常氧组（均P＜0.01）。

图1 HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表达

表2 各组人HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表达（n=8±s）

表2 各组人HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表达（n=8±s）

与常氧组比：aP＜0.01

)常氧组 0.33±0.06144.68±7.30 0.42±0.0526.17±3.38 0.58±0.06 51.45±6.83 0.30±0.0466.24±4.20低氧组 0.57±0.05a187.93±5.60a0.59±0.06a52.70±4.03a0.29±0.04a30.44±7.12a 0.50±0.05a89.76±4.62a

2.2 HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的相关性 VEGF mRNA与AFP、MMP-9 mRNA呈正相关（r=0.820、0.878，P＜0.01），与TIMP-1 mRNA呈负相关（r=-0.880，P＜0.01）；AFP mRNA与MMP-9 mRNA呈正相关（r=0.830，P＜0.01），与TIMP-1 mRNA呈负相关（r=-0.722，P＜0.01）；MMP-9 mRNA与TIMP-1 mRNA呈负相关（r=-0.835，P＜0.01）；VEGF蛋白与AFP、MMP-9蛋白呈正相关（r=0.923、0.876，P＜0.01），与TIMP-1蛋白负相关（r=-0.771，P＜0.01），AFP蛋白与MMP-9蛋白呈正相关（r=0.917，P＜0.01），与TIMP-1蛋白负相关（r=-0.848，P＜0.01），MMP-9蛋白与TIMP-1蛋白负相关（r=-0.863，P＜0.01）。

3 讨论

低氧是实体瘤局部微环境的特征之一。低氧时低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表达上调，转位到细胞核内与HIF-1β形成异二聚体HIF-1。HIF-1与靶基因的启动子或增强子上的低氧反应元件（hypoxia response element，HRE）5’-ACGTGC-3’结合，上调靶基因的表达并介导一系列肿瘤细胞对低氧的反应，肿瘤细胞发生恶性生物学行为改变：糖酵解途径、增殖、侵袭和转移能力增强，对化疗药物产生耐药性，对放化疗不敏感等[1]。VEGF[3]、MMP-9[4]是HIF-1的靶基因，启动子上存在HIF-1结合位点HRE。VEGF基因表达上调促进肿瘤血管新生[3]，同时也是一种免疫调节因子，能够削弱树突状细胞功能而降低宿主的抗肿瘤免疫反应[3]。MMP-9（明胶酶B）属于高度保守的Zn2+依赖的内切蛋白水解酶家族，可降解明胶和IV、V、VII、X型基底膜胶原和细胞外基质，TIMP-1能选择性结合MMP-9活性中心的Zn2+，封闭其催化活性，从而特异性地抑制MMP-9的活性[5]。通常情况下，组织中MMP-9和TIMP-1之间保持着相对平衡状态，它们的平衡和相互影响决定着细胞基质是降解还是聚集和肿瘤的侵袭和转移的能力[6]。本实验显示：低氧应激上调HepG-2细胞VEGF基因的表达，与文献[1]研究结果一致；上调MMP-9基因的表达，与文献[4]研究结果一致；下调TIMP-1基因的表达。低氧应激上调HepG-2细胞MMP-9基因的表达、下调TIMP-1基因的表达，可能是低氧下肝癌细胞侵袭力增强的机制之一。

AFP基因属于白蛋白基因家族，有三个增强子，是原发性肝细胞癌诊断的重要血清标记物，参与细胞增殖和代谢的调节，能促进肝癌细胞增殖[7]。本实验显示：低氧应激上调HepG-2细胞AFP基因的表达。贺涛等[8]研究提示：沉默AFP基因可抑制肝癌细胞的增殖活性。低氧应激上调HepG-2细胞AFP基因的表达可能是低氧下肝癌细胞增殖活性增强的机制之一。

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