针刺治疗重症急性胰腺炎大鼠早期肺损伤组织中iNOS及eNOS mRNA表达影响的初步研究

蒋莉娅，黄继人，赵弘卿，戴建良，张卫东，诸静芬

(1.无锡市第二人民医院中医科，江苏 无锡 214002;2.无锡市中西医结合医院肝胆胰中心，江苏 无锡 214041;3.无锡市第二人民医院呼吸科，江苏 无锡 214002;4.无锡市中医院普外科，江苏 无锡 214001)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)易诱发全身炎症反应综合征(SIRS)及多器官功能不全综合征(MODS)，病死率高。其死亡病例中有50%以上为早期合并急性肺损伤(acute injury of lungs，ALI)，可迅速恶化演变为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，从而成为SAP早期死亡的主要原因［1］。本实验中，我们在中医“肺与大肠相表里”理论指导下，针刺大鼠SAP早期ALI模型的肺、大肠及脾经相关穴位，并通过测定其肺损伤病理评分、肺组织湿/干重、肺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达水平，旨在进一步明确针刺对SAP大鼠ALI的保护作用及其机制［2］。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性 Wistar大鼠 40只，重量 250g±20g，购自南通大学实验动物中心。结晶牛磺胆酸钠、CORM-2购自Sigma公司。iNOS(GenBank中编号NM_012611.3)上游引物 P1:5'-ATC CCG AAA CGC TAC ACT-3'，下游引物 P2:5'-GTC TGG CGA AGA ACA ATC-3'，扩增片段大小为315 bp。eNOS(GenBank中编号NM_021838.2)上游引物 P1:5'-CTC ACC GAT ACA ACA TAC-3'，下游引物 P2:5'-GAG CCA TAC AGG ATA GTC-3'，扩增片段大小为469 bp。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(GenBank中编号NM_017008.3)上游引物 P1:5'-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3'，下游引物 P2:5'-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3'，扩增片段大小为140 bp。以上引物均由上海英骏生物技术公司提供合成，Trizol和逆转录试剂盒购自上海英骏生物技术公司。

1.2 动物模型制备

40只大鼠随机分为sham组、SAP组、针刺治疗组及针刺对照组，每组10只。禁食、自由饮水12h后，1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。sham组模拟造模手术情况，开腹后仅轻度揉搓胰腺、翻转肠管5min后即关腹;SAP组采用胰胆管逆行注入3.5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)的方法建立SAP模型［3］。针刺对照组在 SAP造模手术后0.5h，取穴肺、脾经穴位及其背腧穴，分别为尺泽、孔最、鱼际、少商、地机、三阴交、肺俞及脾俞等，针刺0.5h后起针;针刺治疗组于造模0.5h后，在对照组基础上，加刺大肠经穴位及其背腧穴商阳、合谷、曲池和大肠俞，穴位定位参见《实验针灸学》［4］。

1.3 标本采集及检测

4组大鼠均于造模或术后6h后处死，无菌操作下取出右肺下叶，液氮固定后置于－80℃冰箱保存，备行RT-PCR。取右肺中叶行常规病理学检查并行病理学评分。计算左肺湿/干重比，间接反映肺水肿程度。取冷冻肺组织，用Trizol法抽提总RNA，再根据逆转录试剂盒产品说明书操作步骤合成第一链，合成的第一链分装于 －20℃保存备用。采用 RTPCR法测定其 iNOS及 eNOS mRNA的表达情况。上海英骏生物技术公司合成iNOS、eNOS和GAPDH引物，用ddH2O溶解，分装于 －20℃保存备用。在25μL PCR反应体系中加入 cDNA 1μL，扩增条件为:94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s;循环 30次。最后 72℃延伸 10 min，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。电泳鉴定后用凝胶图像扫描仪测算各条带的光密度值，分别以iNOS、eNOS条带与GAPDH条带光密度值比较表示其mRNA的表达水平。

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0统计软件采用方差分析处理数据，计量数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺脏病理学改变

(1)大体观:sham组肺脏形态、结构基本正常。SAP组肺脏表面暗红并伴有点片状出血灶，水肿明显。针刺治疗组肺脏见少量出血点，水肿轻。针刺对照组肺脏表面有点片状出血点，面积大小介于SAP组和针刺治疗组之间，水肿程度亦介于前两者之间;(2)光镜检查:sham组肺组织结构清晰，肺泡壁薄，无中性粒细胞浸润。SAP组可见肺间质充血、水肿，炎性细胞浸润;肺泡间隔明显增厚，较多的肺泡萎缩，肺泡腔部分融合成肺大泡;毛细血管扩张、充血，局灶性肺泡内出血。针刺治疗组肺组织炎症明显较SAP组减轻。针刺对照组光镜结构、肺组织炎症及肺间质充血、水肿程度均介于SAP组与治疗组之间(图1)。

图1 各组肺组织病理学观察(HE染色 ×100)

2.2 其他指标

表1图2显示，针刺治疗组的肺湿/干重比和病理学评分较 SAP组、针刺对照组均显著降低(P＜0.05);与SAP组和针刺对照组相比，针刺治疗组肺组织中iNOS及eNOS mRNA表达也明显下降(P＜0.05)。

表1 各组肺组织病理评分、肺组织湿/干重比、iNOS及eNOSmRNA表达的检测结果比较(±s)

表1 各组肺组织病理评分、肺组织湿/干重比、iNOS及eNOSmRNA表达的检测结果比较(±s)

注:与sham组比较:*P＜0.05;与 SAP组比较:#P＜0.05;与针刺对照组比较:△P＜0.05

组 别 肺湿/干重比 病理学评分iNOS mRNA eNOS mRNA Sham 组4.51 ±0.36 0 0.43 ±0.12 0.13 ±0.04针刺治疗组 4.75 ±0.61#△ 5.64 ±0.460#△ 0.56 ±0.32#△ 0.24 ±0.05#△SAP 组 5.89 ±0.87* 7.95 ±1.540* 1.03 ±0.11* 0.72 ±0.06*针刺对照组 5.31 ±0.33* 6.05 ±1.024* 0.76 ±0.33* 0.45 ±0.05*

图2 各组肺组织中iNOS和eNOS mRNA的表达水平

3 讨论

SAP引起的全身炎症反应能导致远隔脏器功能障碍，其中 ALI是患者早期死亡的主要原因。ALI的主要病理变化是弥漫性肺泡和肺泡毛细血管膜损伤，大量炎性渗出积聚在肺间质和肺泡腔中形成充血、水肿［5］。研究发现，SAP器官衰竭发生率约为72% ～90.3%，其中肺脏衰竭最为常见，其次为心血管系统、肝脏和肾脏。因此，防治肺损伤成为降低SAP早期死亡率的重要措施。

NO是一种具有自由基性质的生物信息分子和效应分子，可参与体内多种生理和病理反应过程。生理状态下机体一般产生低浓度和短暂的 NO，主要作为生物信使分子和细胞保护剂对机体起保护作用。而在病理状态下，高浓度的NO可抑制三羧酸循环和DNA复制中关键酶的活性，造成能量代谢障碍和 DNA损伤，并增强核转录因子 κB(NF-κB)活性，进而增加 TNF-α等前炎症细胞因子的产生，扩大炎症反应，导致肺损伤。NOS是NO的一种合成酶，有nNOS(原生型)、iNOS及eNOS 3种类型。它在生理状态下很少表达，但在炎症、创伤等情况下表达增强，并使NO的分泌增加。SAP时NOS诱导机体产生的大量NO，对组织细胞具有损伤作用，参与机体多种疾病(如急性肺损伤、心血管失代偿、消化道出血、急性肾功能衰竭、胰性脑病以及ARDS等)的发病过程。

有关“肺与大肠相表里”理论，早在《黄帝内经》中就有记载。《灵枢·经脉》:“肺手太阴之脉，起于中焦，下络大肠……上膈属肺。”“大肠手阳明之脉，络肺下膈属大肠”。该理论总结的宏观规律指出，在空间和功能上不同的两个脏腑，在生理和病理上具有密切联系［6］。消化管、呼吸道及腺的上皮组织大多来源于原始消化管的内胚层，这种胚胎学上的共同来源被认为是“肺与大肠相表里”的生理结构基础。

中医学认为，胰腺炎发病多因饮食不节，损伤脾胃，酿湿生热化毒，导致气滞血瘀，湿热壅结，水热互结，阳明腑实。孙思邈《千金要方》中有以下记载:“脾重二斤三两，扁广三寸，长五寸，有散膏半斤……凡脾脏像土，与胃合为腑。”根据上述文献记载，本实验组更倾向于现代医学中的“胰”接近于古代医学中“脾”的观点。

经验表明，单一或联合运用通里攻下、活血化瘀及清热解毒汤剂口服、灌胃或保留灌肠等，均能在SAP早期有效地保护胰腺及减轻胰外器官的损伤。针灸的调节效应具有即时和多器官性。本实验中，针刺治疗组选择针刺SAP大鼠肺经的尺泽、孔最、鱼际和少商，能清热解毒保肺，抑制肺组织中性粒细胞的大量浸润;大肠经的商阳、合谷和曲池，能促进胃肠道的排空，通里攻下，减少肠道细菌易位;胰腺在十四经中无完全对应的经脉，可选择脾经代替，地机为脾经“郄穴”，郄主急，故治疗急性重症胰腺炎有奇效。三阴交为足三阴经之会，“脾俞”为脾经背腧穴，脾统血，上述脾经三穴活血化瘀、引血下行。诸穴合用，共奏清胰保肺之功［2］。

本实验中，SAP导致肺组织病理学评分、肺组织湿/干重比明显升高，而针刺治疗组则显著降低了上述指标，说明针刺可以有效减轻SAP并发的ALI，针刺治疗组上述指标低于对照组，进一步说明在“肺与大肠相表里”理论指导下的针刺治疗组效果更为明显。为探讨其机制，我们通过检测针刺对SAP大鼠肺组织中iNOS和eNOS mRNA的表达水平，探讨内源性NOS在肺损伤中的作用。结果显示，在SAP造模后6h后，针刺治疗组肺组织iNOS、eNOS mRNA表达量均高于sham组，而低于SAP组和针刺对照组，这表明iNOS和eNOS mRNA的过量表达可能在SAP肺损伤中起重要作用，分析其原因可能是由于SAP时血循环来源的炎症介质、细胞因子以及一些具有催化活性的酶等因素均能启动细胞内基因转录，诱导 iNOS和 eNOS mRNA表达增加，催化产生大量的 NO，NO能强烈扩张肺毛细血管，增加血管通透性和蛋白溢出，造成肺组织低灌注、血流瘀滞、局部炎症反应和通气/血流比值失调，导致肺组织出现炎性细胞浸润、间质水肿、充血等一系列病理生理过程。

研究表明，肺泡巨噬细胞活化可能是急性胰腺炎肺损伤的重要途径。肺泡巨噬细胞活化后可产生许多活性介质，如NO、TNF-α、花生四烯酸等代谢产物，这些物质均为前炎症介质，可引起炎性细胞聚集并浸润入肺，引起肺损伤。本课题的以往研究［2］提示，针刺能显著减轻SAP时肺组织损伤，其机制与抑制巨噬细胞功能、抑制肺泡巨噬细胞分泌 TNF-α和下调NO水平有关。结合本次实验结果，从而得出结论:在“肺与大肠相表里”理论指导下的针刺治疗，能显著减轻SAP早期肺组织损伤，其机制可能与抑制肺泡巨噬细胞iNOS和eNOS mRNA过量表达，从而显著下调NO水平有关。而明确其机制，从而深入阐释“肺与大肠相表里”理论指导下针刺对SAP大鼠早期肺损伤的保护作用，仍有待于进一步的研究。

［1］Liu HB，Cui NQ，Li DH，et al.Role of Kupffer cells in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis-associated lung injury of rats［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):403-407.

［2］蒋莉娅，黄继人，赵弘卿，等.“肺与大肠相表里”理论在针刺治疗重症急性胰腺炎大鼠早期急性肺损伤中应用的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2011，17(11):1245-1247.

［3］张明钧，姚玮艳，乔敏敏，等.肠壁穿刺逆行胰胆管注射牛黄胆酸钠重症急性胰腺炎造模［J］.上海交通大学学报(医学版)，2006，26(5):488-490.

［4］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:327-329.

［5］PavlidisTE， PavlidisET， SakantamisAK. Advancesin prognostic factors in acute pancreatitis:a mini-review［J］.HBPD INT，2010，9:482-486.

［6］李杰，程欣，贾钰华.肺与大肠相表里物质基础研究方法的探讨［J］.中国中西医结合杂志，2011，31(2):256-259.