电针对抑郁模型大鼠五羟色胺及脑源性神经营养因子的影响

史榕荇 ，吴 茜 ，于战歌 ，李 辉 ，田旭升 ，唐学章 ⋆

（1.中日友好医院 针灸科，北京 100029；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

抑郁症是精神疾患的常见病种，因为发病率高，知晓率低，危害严重，给家庭和社会造成沉重负担。近年来，抑郁症的预防和治疗得到学术界的广泛关注，但由于发病机制至今没有得到肯定、明确的揭示，其发病率不降反升[1]。

近现代以来，临床医生将电针疗法广泛应用于抑郁症的治疗，取得肯定的疗效，认为电针对抑郁症起整体调节作用，可以干预机体恢复固有的动态平衡。1984年，罗和春[2]开始对电针治疗抑郁症进行规范化研究，为电针的作用机制提供了颇具说服力的科学佐证。

迄今为止，比较明确的是脑内5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神经系统失衡改变与抑郁症发病有直接的关系[3]，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 对脑神经细胞具营养作用，而5-HT能神经元与BDNF因子之间存在交互作用。有实验得出电针可抑制HPA轴亢进，同时提高损伤大脑海马内BDNF蛋白表达[4]。本研究观察了电针对抑郁模型大鼠海马内5-HT、BDNF含量表达的影响，以探讨电针调整抑郁症大脑功能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物和分组

雄性 SD 大鼠，120 只，体重 160～180g，维通利华实验动物技术有限公司提供。通过开野实验将水平运动次数加垂直运动次数不足30次或超过120次的大鼠剔除，选取符合条件大鼠40只随机分组。实验期间除特殊要求外，其余时间均饲养于温度（18℃～25℃）和湿度（55%±2%）相对恒定的动物饲养室，自然光线，自由进食水；随机分为4组：空白对照组、抑郁模型组、阳性西药对照组（氟西汀）、电针治疗组，每组10只。

1.2 造模和干预方式

造模动物全部孤养，实验期间每天随机给予一种应激刺激，包括断食（24h）、断水（24h）、昼夜颠倒（24h）、夹尾（180s）、温箱（40℃，5min）、冷水游泳（14℃，5min）、电击足底（电压 30V，电击 5s，间歇5s，共进行120s）平均每种刺激3次，共21d。参照 “实验动物针灸穴位图谱”（全国针灸学会实验针灸研究会制定）选取大鼠百会、印堂穴，平刺进针，百会穴针尖方向向后头部，印堂穴针尖方向向鼻尖，刺入深度约为0.5～1cm，使用HANS，LH202型电针治疗仪0.6mA/2Hz，每次造模前1h对电针组行电针干预，1次/d，每次20min，共21d。造模期间，每天应激刺激前1h西药对照组灌胃给药氟西汀（fluoxetine，氟西汀），美国礼来公司生产，批号 104041，按 0.18mg/kg体重，0.018mg/ml浓度灌胃给药，1次/d，共21d。

1.3 检测指标

1.3.1 酶联免疫吸附法样品制备及检测

最后一次实验结束后，大鼠断头于冰皿上快速剥离海马，用生理盐水冲洗干净，立即放入清洁的5ml塑料离心管中，置于－85℃冰箱中备用，检测5-HT的含量。

检测方法按试剂盒说明书进行操作。实验用试剂盒由北京尚柏生物医学技术有限公司提供，美国Biosource公司生产。

1.3.2 Western-blot法样品制备及检测

实验用抗体：羊抗兔抗BDNF为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品；DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪，北京市六一仪器厂；X光胶片自动冲洗机为美国Proce公司产品；FluochemV2.0型凝胶图像分析系统为美国阿尔法公司产品。

使用超声匀浆器在冰上迅速研碎海马组织；加入400μl含PMSF的变性裂解缓冲液，在冰上放置30min；裂解30min后，用移液器将裂解液移至2ml离心管中，4℃，12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置-20℃保存。使用紫光分光光度法测样品中蛋白浓度。取10μl样品，稀释40倍至400μl，置分光光度计中检测OD260和OD280。计算蛋白浓度。根据测定的蛋白含量，取含50μg蛋白的样品溶液，加入1/4体积5×buffer，混合后于沸水中煮10min使蛋白变性，等待上样；加入样品，接通电源开始电泳，条带在积层胶范围时使用80V电压，到达分离胶时改用120V电压。半干式电转移法将胶中蛋白质转移至膜上，封闭实施免疫反应，加入一抗，4℃过夜。用封闭液将抗兔二抗以1：2000比例稀释，将β-Actin所处部位的膜置于抗体溶液中，排尽气泡，分别密闭袋口，室温缓缓摇动1h。暗室中，将膜蛋白面朝上放入X光片夹中，曝光2min后洗出胶片。用凝胶图像分析系统扫描胶片，并分析目标条带的分子量和净光密度值。目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

1.4数据处理

对原始数据进行单因素方差分析。

2 实验结果

2.1 电针对抑郁模型大鼠海马内5-HT的影响

由表1可见，给予慢性应激刺激后，模型组大鼠海马5-HT含量较正常组显著减少 （P＜0.01），电针组大鼠海马5-HT含量较模型组显著增加（P＜0.01）。

表1 电针对抑郁模型大鼠海马5-HT含量的影响（x-±s）

表2 各组BDNF蛋白含量的比较（x-±s）

图1 BDNF在海马组织表达的蛋白印记图

2.2 电针对抑郁模型大鼠海马内BDNF蛋白含量表达的影响

由表 2及图1的Western blot印迹结果可见，实验结束后各组大鼠海马中BDNF蛋白均有表达，与正常组相比，模型组BDNF蛋白表达量显著降低（P＜0.01）；电针组蛋白表达量较模型组显著增加（P＜0.01）。

3 讨论

电针和电休克疗法（ECT）均对头部进行电流刺激，二者作用机制可能有相似之处。有研究表明，ECT可改变大鼠脑内不同区域多个基因表达，这些基因参与多条神经传导通路，而其中CREB（cAMP response element binding）-BDNF 通路为近年来研究的热点。有研究[5]表明，改变CREBBDNF通路相关基因的表达，阻断、逆转神经元细胞的萎缩和凋亡，对恢复脑的功能可产生积极意义。电刺激通过改变抑郁症神经可塑性基因的表达而改善抑郁症症状，为电针干预抑郁症神经营养假说的研究提供了新思路[6]。

有药理学实验结果表明，5-HT再摄取抑制剂等药物治疗的起效出现延迟，时间约为4～6周，这表示该种机制仅为抑郁症发病机制的一部分，而神经可塑性机制的存在，一定程度上解释了这种效应延迟现象[7]。我们的研究证实：模型大鼠出现海马内5-HT含量降低，同时观察到脑神经营养因子表达降低，说明抑郁状态下BDNF表达降低，神经元营养障碍，这是导致神经细胞形态、功能受损可能的原因。电针能够有效抑制模型大鼠海马内5-HT水平变化，同时增加海马内BDNF蛋白表达含量，维持神经可塑性、保护神经功能产生良性调节，这是电针对抑郁模型大鼠产生良性干预作用可能的机制。本实验还观察到，电针可同时对5-HT系统和脑神经营养因子产生良性干预，再次印证了电针对机体产生多环节、多靶点的平衡调节作用，这是电针起效迅速，而无毒副作用等不良反应的可能原因。

本研究为电针对脑源性神经营养因子影响观测的初步结果，至于电针在整条神经营养通路中如何起效，电针调节CREB-BDNF通路上多环节、多靶点的机制，以及电针调整5-HT系统与脑源性神经经营养因子系统之间交互作用的内在联系等问题，尚待进一步探讨和研究。

[1]黄泉智，许成勇，王发渭.中医治疗抑郁症的现状与展望[J].中华保健医学杂志，2011，13（2）：77-78.

[2]罗和春，钱瑞琴.中西医结合治疗抑郁症新进展[J].中国中西医结合杂志，2009，29（3）：197-198.

[3]王树桂，潘莹.抑郁症药物治疗进展[J].中国民族民间医药，2011，（1）：35-36.

[4]李文迅，韩焱晶，陶娟，等.电针对抑郁模型大鼠海马神经元凋亡影响的研究[J].中国中医药信息杂志，2005，12（2）：33-35.

[5]Altar CA，Laeng P，Jurata LW，et al.Electroconvulsive seizutes regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways[J].J Neurosci，2004，24：2667-2677.

[6]Molteni R，Calabrese F，Bedogni F，et al.Chronic treatment with fluoxetine up-regulates celluar BDNF mRNA expression in rat dopaminergic regions[J].Int J Neuropsychopharmacol，2006，9：307-317.

[7]徐林.抑郁症的神经可塑性机制[J].中南大学学报，2008，34：326-330.