MALDI质谱成像的样本制备技术及应用研究进展

徐 静，万家余，许 娜，许 琴，李 楠，王景龙，刘文森

（军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

MALDI质谱成像的样本制备技术及应用研究进展

徐 静，万家余，许 娜，许 琴，李 楠，王景龙，刘文森＊

（军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

＊通讯作者

MALDI质谱成像技术（Maldi tof Imaging Mass Spectrometry，MALDI-IMS），是利用 MALDI质谱技术将得到的蛋白组学数据，结合计算机辅助成像产生分子图像，进而描绘出组织上已知及未知分子分布情况的新技术。该技术已被广泛应用于生命科学的很多领域，如动植物生理学、病理学［1－3］、药物研发［4－6］等。

1 样品制备技术

MALDI质谱成像实验的关键是样品的制备［7］，它主要包括冰冻切片的制备和基质的选择及应用等。

1.1 冰冻切片的制备冰冻切片的制备是一项比较成熟的技术，但为了保证质谱成像结果的重复性和准确性，在质谱成像技术应用范围不断得到拓展的同时，组织样品的储存、包埋以及切片厚度选择等方面也得到了不断的优化和改进。对于组织样品的储存，过去多推荐采用液氮快速冷冻后储存于－80℃的方法，但新鲜组织放置于液氮中其内部会因受冷不均匀而导致组织裂开，常常影响实验的重复性。Goodwin等［8］使用－70℃或更低温度的乙醇或异丙醇代替液氮，经过多次实验证明该方法在避免冻存组织裂开方面效果显著。冷冻切片制备过程中包埋剂的选择也值得关注，对于普遍使用的包埋剂OCT（Optimal cutting temperature polymer），由于其易离子化而使质谱信号强度下降，所以应尽量避免使用OCT包埋剂或使用OCT时避免污染样本，现在多采用冰或聚合树脂代替OCT来作为包埋剂［9］。切片的厚度对于MALDI-IMS实验结果有很大影响，切片不易过厚，因为厚切片中一些对离子信号有干扰的物质不易被乙醇充分清洗掉，另外，切片越厚其表面覆盖基质之后，相对于MALDI导电玻片的绝缘性就越强，所以薄切片具有较低的电荷效应，3－5μm厚度的冰冻切片易于得到质量较好的质谱图，尤其适合检测m／z较大分子［10］。

1.2 基质的选择及应用高质量的 MALDI-IMS图像从根本上依赖于高效的基质对分析物的沉淀。高效的基质可以从样品中最大程度的抽提出分析物，同时限制分析物的扩散，且能够产生比MALDI分辨率更小的结晶，MALDI-TOF的空间分辨率一般为25－50μm。MALDI-IMS实验中常从选择恰当的基质（表1）［11］及浓度，挑选合适的溶剂组分，使用高效的基质覆盖方法方面来优化实验方案。合适的基质溶剂应既能将组织切片湿透、充分溶出分析物，同时又能快速干燥，有效避免样品的迁移现象。基质的覆盖方法原则上有两种，喷雾法和点样法。比较两种方法，喷雾法在喷雾和干燥循环交替进行时易引起切片表面过湿，导致组织切片上分析物的位置迁移，另外基质结晶的尺寸和同质性也容易因为操作不同而受影响。点样法产生的基质液滴体积为80－150pL，可形成直径为100－200μm的圆形基质结晶区域，其在一定程度上限制了分析物的空间位置迁移，但图像分辨率易受到基质斑的直径和间距的影响。

具体在实验中，要结合分析物性质来选择。大量的实验围绕基质的选择及运用方法的优化展开，取得了很多宝贵的数据和经验。此外，针对不同种类的研究对象，在基质应用方面科学家们进行了一些有益的探索值得借鉴，如Satu M.Puolitaival1等［12］实验证明利用升华作用得到的基质层沉淀均匀，不易发生分析物空间位置迁移现象，特别适用于组织内磷脂分子成像。Ruibing Chen等［13］通过调整基质喷洒器的喷口与MALDI样品靶之间的距离和喷射基质溶液的流速，产生相对干和湿两种基质覆盖状态，分别采集质谱数据后比较结果发现，对于分子量小于900Da的脂类，这两种基质覆盖状态下所得到的质谱信号强度和峰型基本没有差别。

2 MALDI质谱成像在生命科学领域最新研究成果

2.1 基础医学研究中的应用MALDI质谱成像作为提供唯一全面的组织内分子分布信息的技术，已成为科学家研究生命体内各种生理和病理过程分子机制的最有力的手段。Vladimir等［14］利用MALDI质谱成像得到饱和烃、不饱和烃（HCs）和蜡酯（WEs）在灰色麻蝇的翅膀和腿部、普通果蝇翅膀以及椰枣树叶表面的分布图像，建立了在昆虫及植物角质层表面直接进行脂类和烃类化合物分子成像的实验方法，该方法正被应用于果蝇体表化学信息的研究中。

表1 常用的基质及应用范围

Stephanie S.DeKe 等［15］利 用 MALDI-TOFTOF，进行甲壳类动物神经组织内神经肽的分子成像实验，得到了两种蟹（Jona h crab和cancer borealis）的脑和心包器官内神经调节辅助成分的分子分布图像，建立了质谱成像实验中复杂多样的内源性信号分子的样品制备方法。这种器官水平的质谱成像研究将有助于阐明同一神经肽家族内部不同神经肽亚型间的空间分布关系，以及不同神经肽家族之间的相对分布关系。

Yuki Sugiura等［16］利用MALDI质谱成像技术阐明了不同神经节苷脂分子的分布，尤其探明了按照神经鞘氨醇含碳原子数目分类的C18－神经节糖苷和C20-神经节糖苷的分布差异，前者广泛的分布在前脑部位，后者选择性的沿内嗅区到海马投影区分布，尤其在齿状回（DG）分子层分布较多。该实验首次证明了神经节苷脂在脑内分布的选择性，并推测这种选择性与不同区域表达的神经节糖苷的功能差异有关。

2.2 药物研发中的应用MALDI质谱成像技术在药物研发方面有着广泛的应用前景，如可用于药物靶向筛选、组织器官或细胞内药物及代谢产物分布等方面研究。Végvári等［17］设计了一种内置于压力调控微芯片上的微量分配器平台系统，其可耐受多种有机溶剂，最小可沉淀体积为100pL的基质液滴，并可通过软件尝试多种基质沉淀策略。基于该基质覆盖技术的MALDI质谱成像实验，在肺组织切片中成功检测到了治疗肺慢性阻塞性疾病（COPD）的药物Tiotropium的两个二级离子信号，分别是152.1和170.1Da，实验结果证明该技术沉淀基质的重复性好，能形成指定厚度的基质层，非常适用于小分子药物的研究。

2.3 疾病早期诊断中的应用MALDI质谱成像技术在寻找疾病生物标记物、研发疾病早期诊断方法等方面具有其他技术无法比拟的优势，已逐渐成为该领域内的研究热点。Shuichi Shimma等［18］利用MALDI-IMS技术寻找人类结肠癌疾病的生物标记物，由于磷脂在细胞膜组分中发挥重要的作用，所以将其作为重要检测目标，实验最终发现两种磷脂分子存在明显的表达差异，并使用MS／MS技术进行了鉴定，可作为该病潜在的生物标志物进行进一步研究。

A.F.Maarten Altelaar等［19］利用 MALDI质谱成像进行了大白鼠、小白鼠及人脑垂体内神经肽的序列差异分析，由于垂体切片小（直径102－103 μm），实验中将 MALDI-IMS技术分别与离子显微镜和 TIC（total-ion-count）成像技术结合使用，得到500nm的像素点和4μm的空间分辨率，弥补了MALDI-IMS分辨率相对较低的弱点。这一技术可用于寻找正常组织病变后小肽或蛋白质发生的氨基酸序列异常变化（如：氨基酸置换、翻译后修饰改变等），这将对于疾病的快速诊断具有重要意义。

Siddharth S.Samsi等［20］提出了一种区分滤泡性淋巴瘤的类别的系统化实验方法，将甲醛固定石蜡包埋的组织块，切成5μm厚的切片，进行切片原位酶解后 MALDI质谱成像分析，同时进行H＆E染色分析，再将质谱成像得到的蛋白组学数据结合组织形态学，有望发展一种新的诊断工具，即通过MALDI质谱成像区分滤泡、套膜、滤泡内区域，进而更加准确的对滤泡性淋巴瘤进行诊断和分类。

3 结语

MALDI质谱成像技术发展迅速，与其他成像技术相比存在显著优势。首先，其所得到的质荷比（m／z）信息是以分子的原子组成为基础，是已被普遍采用的参数，该技术不需要对分析物进行标记，便可对未知分子成像；其次，借助质谱仪的高分辨率，还可以区分分子间的细微差别；第三，尽管次级离子质谱（SIMS）的分辨率可达1μm，明显高于 MALDI，但SIMS质量测量范围明显不及MALDI。另外，MALDI仪器的广泛应用，也是其快速发展的重要原因之一。

MALDI质谱成像技术作为快速、直观的蛋白组学研究工具前景十分广阔，但在具体实验中还存在很多技术上的难题。一方面，在研究药物及其代谢产物组织内分布方面，由于药物分子在组织细胞内含量低，对实验灵敏度要求较高，因此实验中基质选择及应用方法方面仍需要进行较多的尝试［21，22］。另一方面，利用质谱成像技术筛选得到的未知蛋白质的鉴定相对小肽的鉴定仍存在较多困难，使用显微切割系统结合标准的蛋白组学方法对组织切片上目的蛋白进行鉴定，或者对组织切片原位酶解后利用二级质谱方法对肽段进行鉴定，均易受到组织上目的蛋白的弥散分布、蛋白水解过程或者目的蛋白丰度较低等因素的干扰，而很难得到令人满意的实验结果。因此，建立完善和成熟的 MALDI质谱成像实验方法仍然是这一技术优势得到充分发挥的前提和基础。

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1007－4287（2012）10－1939－04

国家自然科学基金（30972197）

徐静，31岁，女，硕士，助理实验师，研究方向：疯牛病发病机制研究。

2012－06－16）