槲寄生碱体外通过激活Caspase8诱导ACC细胞的凋亡

邱心如，周洪澜，李亚娟，张丽红，翟颖仙，王医术＊

（1.吉林大学a.药学院2009级；b.第一医院；c.病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.四平市中心人民医院）

唾液腺腺样囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，大约占唾液腺恶性肿瘤的20%［1］。近年来，槲寄生Viscum Coloratum（Kom.）Nakai的抗癌作用受到国内外医药学界的极大重视。在亚洲，韩国对槲寄生抗癌作用的研究较多，他们主要提取槲寄生的外源凝集素（Lectins）作抗癌研究［2，3］。在我国，早在1994年王庆瑞等人就曾经报道，槲寄生的总生物碱具有较强的抗肿瘤作用，是槲寄生中有效的抗肿瘤成分之一［4］。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用［5，6］。基于此，本实验主要研究槲寄生碱作用ACC细胞后，Caspase家族中关键因子Caspase8的表达情况。

1 材料和方法

1.1 材料

药物及试剂：槲寄生碱粉末由吉林大学基础医学院药化实验室制备；新生牛血清购于TBD公司；RPMI1640培养液、胰蛋白酶购于美国Gibco公司；5－氟尿嘧啶购自天津金耀氨基酸公司；ACC细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。Caspases8多克隆抗体购于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 槲寄生碱的配制 根据文献采用稀盐酸浸提法［1］提取，用 NaOH 将pH 值调至6.5左右，制成槲寄生碱溶液，浓度为1mg／ml。

1.2.2 细胞培养 ACC细胞培养于含10%FCS的RPMI1640培养液中，培育在37℃、5%CO2培养箱内，达到对数生长期后，进行实验分组：①对照组：未用槲寄生碱处理的正常生长细胞；②阳性对照组：采用5-FU处理ACC细胞；③实验组：采用槲寄生碱（2.24μg／ml）处理 ACC细胞。

1.2.3 细胞爬片 加药后立即将细胞（5×104／ml）接种于已经铺好盖玻片的24孔板内，37℃、5%CO2培养24小时后0.1%PBS冲洗，10%中性福尔马林固定，于－20℃冷藏备用。

1.2.4 caspase8活性的检测 免疫组织化学染色采用SP法。

2 结果

2.1 Caspase8的表达情况

Caspase8免疫组织化学染色发现，槲寄生碱作用组ACC细胞胞浆有棕黄色颗粒，呈阳性表达，并且随着碱浓度的升高，表达增强。阳性率高于5-FU组（P＜0.001），未加药组细胞胞浆无明显棕黄色反应物（P＜0.001）（结果见表1，图1）。

表1 ACC细胞Caspase8表达的IOD值（±s）

表1 ACC细胞Caspase8表达的IOD值（±s）

各组间比较P＜0.001

组别 剂量（μg／ml） IOD值－ 168818.2±11592.21槲寄生碱组 2.24 723574.7±8007.34 5-FU 组未加药组111.90 664603.9±8540.64

图1 ACC细胞Caspase8的表达（100×）

3 讨论

细胞的凋亡涉及到一系列基因的激活、表达及调控，其过程大体上可以分为三个阶段［7］：接受凋亡相关信号→整合信号，凋亡调控分子间相互作用→蛋白水解酶（Caspase）激活，进入不可逆的连续反应过程。在不同的凋亡途径当中，天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate specific protease，Caspase）发挥了关键性作用［8］。文献显示，在死亡受体途径中，细胞膜上的Fas被激活后，将凋亡信号传导入胞内，自身形成三聚体，通过DD（death domain，死亡结构域）与FADD（Fas associated protein with death domain，Fas相关死亡结构域蛋白）结合，而FADD中含有的 DED（death effected domain，死亡效应结构域）是Caspase8中CARD（Caspase activation and recruitment domai，Caspase激活募集结构域）的一种，从而使procaspase8自身水解活化，进一步去激活Caspase3来促进细胞的凋亡［9］。诱导Caspase8才能实现其凋亡过程。李钢琴等人在实验中证实丹皮酚即是通过上调Fas、Caspase8的表达来诱导大肠癌HT－29细胞的凋亡［10］。韩阳等人亦在实验中证实Caspase8在死亡受体途径中第一步被激活，进而活化下游的Caspase来诱导细胞凋亡［11］。

基于此，本实验研究的目的是槲寄生碱作用SACC后观察caspase8表达情况，结果显示Caspase8免疫组织化学染色发现，槲寄生碱作用组ACC细胞胞浆有棕黄色颗粒，呈阳性表达，并且随着碱浓度的升高，表达增强。阳性率高于5-FU组（P＜0.001），未加药组细胞胞浆无明显棕黄色反应物（P＜0.001）。因此，可以认为槲寄生碱通过Caspase8诱导ACC细胞凋亡，槲寄生碱有可能成为一种治疗腺样囊性癌的有效药物，它的研制与开发利用，将为人类攻克肿瘤这一顽疾开辟一条新的道路。

［1］Spiro RH.Salivary neoplasms：Overview of a 35-year experience with 2 807patients［J］.Head Neck Surg，1986，8（3）：177.

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［3］Taek Joon Yoon，Yung Choon Yoo，Tae Bong Kang，et al.Cellular and humoral adjuvant activity of lectins isolated from Korean mistletoe（Viscum album colaratum）［J］.International Immunopharmacology，1（2001）：881.

［4］王庆端，刘梅筠，王东阳.槲寄生总生物碱的抗肿瘤作用［J］.中国中药杂志，1994，19（1）：46.

［5］Shintani M，Sangawa A，Yamao N，et al.Immunohistochemical analysis of cell death pathways in gastrointestinal adenocarcinoma［J］.Biomed Res，2011，32（6）：379.

［6］Fang Xiaoyang，Sheng Wei.Studies on Chinese materia medica inducing tumor cells apoptosis［J］.中草药，2004，4（34）：472.

［7］Eastman A，Rigas JR.Modulation of apoptosis signaling pathways and cell cycle regulation［J］.Semin Oncol，1999，5：7.

［8］Bratton SB，MacFarlane M，Cain K.Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis［J］.Exp Cell Res，2000，256：27.

［9］赵 丹.FADD研究进展［J］.国际免疫学杂志，2006，29（3）：152.

［10］李钢琴，谭诗云，刘长青，等.Fas／FasL、bcl 2、caspase 8在丹皮酚诱导大肠癌细胞凋亡中的相互作用及机制［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2006，15（2）：194.

［11］韩 阳，官大威，侯震寰，等.caspase-8及其研究进展［J］.中国法医学杂志，2006，21（2）：94.