高纯度水飞蓟宾相关杂质研究

武俊明 陆继好

水飞蓟素(Silmyarin)是指从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取所得的一种黄酮木脂素类化合物。主要的活性成分有水飞蓟宾(Silybin)、异水飞蓟宾(Isosilybin)、水飞蓟亭(Silychristin)和水飞蓟宁(Silydianin)等四种同分异构体，水飞蓟用来治疗肝胆疾病已有2000多年的历史，被称为“天然的保肝药”，本文采用三已知对照品进行了杂质检查方法可行性的初步验证，采用杂质对照品进一步验证方法对已知杂质检测的可行性。并对杂质对照品进行了必要的结构确证资料。

一、仪器和试剂

BRUKER AV500型核磁共振仪

仪器：PU－1580液相色谱仪(日本Jasco公司)

UV－1575紫外检测器(日本Jasco公司)

N－2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)。

样品来源：江苏中兴制药有限公司

样品批号：20110501 20110502 20110503

水飞蓟宾对照品批号：20070201含量：99.97%

二、已知杂质研究

1.三个已知杂质对照品核磁共振谱的确定

根据文献，水飞蓟宾有三种主要有关物质，分别为水飞蓟亭、水飞蓟宁、异水飞蓟宾(A+B)，实验结果表明，除去DMSO－d6溶剂峰(δ2.50，7重峰)、精制样品时所用溶剂峰(δ3.29)和杂质峰，三个物质的氢谱归属结合了水飞蓟宾的氢谱归属，各个物质H的归属结果三个物质归属结果和文献相一致，从上可以证明三个杂质分别为水飞蓟亭、水飞蓟宁和异水飞蓟宾(A+B)。

2.已知杂质检测的专属性试验

色 谱 柱：Shimpak CLC －ODS 15cm ×6.0mm，5um

流动相：甲醇∶水∶冰醋酸=41∶59∶5

检测波长：288nm

流量：1.0ml/min

进样量：20μl

柱温：30℃

分别精密称取异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭对照品适量，加甲醇超声使溶解，并稀释制成约40ug/ml的溶液，另取水飞蓟宾适量加甲醇超声使溶解，并稀释制成1mg/ml的供试液。分别精密量取异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭溶液各1ml，置于10ml容量瓶中，加入水飞蓟宾供试液稀释定容至刻度，摇匀，制成混合溶液，进样20μl。

由结果可知：按照本品的有关物质方法均能有效地检测出异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭已知杂质，两峰之间的分离度为1.642，与前后峰的分离度分别为1.990和2.004，理论塔板数为4766。按照本品的有关物质方法考察异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭等杂质的分离检出情况良好，符合规定。

三、自制样品和上市原料有关物质的比较

取本品适量(约相当于水飞蓟宾25mg)，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声20分钟，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液;精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的2倍，测定波长为288nm，三批样品、上市药品及中检所对照品的按面积归一化法计算有关物质，结果见表1。

表1 有关物质检查结果

未知杂质B 0.02 0.02 0.03 0.03 0.14未知杂质C 0.02 0.04 0.03 0.02 0.07未知杂质D / / 0.03 / /未知杂质E 0.18 0.17 0.12 0.23 0.23未知杂质F / / / 0.04 /水飞蓟亭 / / / / /水飞蓟宁 / / / / /异水飞蓟宾 0.23 0.26 0.29 0.14 0.22总杂质0.45 0.51 0.50 0.47 0.66

结论：参照《化学药物杂质研究的技术指导原则》本品最大日剂量为420mg(≤2g)，故本品报告限0.05%，鉴定限0.10%，质控限0.15%。其中未知杂质E和已知杂质异水飞蓟宾大于鉴定限和质控限，未知杂质E含量明显低于已上市产品杂质实测值;已知杂质异水飞蓟宾是水分蓟素中主要有效成分之一，见文献。

四、讨论

在水飞蓟素中水飞蓟宾含量最高，活性也最高。常凤岗等研究了我国引种的水飞蓟化学成分，得到两个单体，并与国外的栽培品种进行了比较鉴定为水飞蓟宾和水飞蓟宁。

本文对已知杂质数量文献检索和核磁共振谱结构确证研究，采用杂质对照品进一步验证方法对已知杂质检测的可行性。参照《化学药物杂质研究的技术指导原则》和上市原料药有关物质进行对比分析，对含量大于鉴定限和质控限但小于上市原料的未知杂质E进行质谱分析和DAT全波长分析，确定为同一杂质。

1 定天明、田颂九、张正行、谷道昭、施蕴华、孙曾培等.水飞蓟素制剂中有效成分HPLC分离测定［J］.药物分析杂志，1999，19(3)：304－307.

2 苑辉卿等.水飞蓟素近期研究，国外医学.中医中药分册1996，18(1)：3－5.

3 朱铉等.水飞蓟素制剂的研究进展，中国野生植物资源，2001，20(3)：47－49.

4 吴知行等.水飞蓟宾及其水溶性衍生物和制剂含量测定方法的研究 南京药学院学报，1981，12(2)：28－36.