胶质瘤细胞系摄取BPA的实验研究

杨 磊，王 潇，隋 丽，孔福全，郝小娟，郑洁莹，马南茹，崔素珍，刘权卫，赵 葵

(中国原子能科学研究院，北京 102413)

1 前言

癌症对人类健康威胁极大，癌症病人每年新增逾百万，其中恶性肿瘤的死亡率相当高，因此，癌症的诊断和治疗已成为医学上的一大难题。传统的肿瘤治疗方法有化疗、放疗和外科手术等，尽管这些治疗方法对某些癌症取得了一些成功，但对部分恶性肿瘤(如脑胶质瘤和黑色素瘤等)，上述治疗方法尚无能为力。

理想的放射治疗方法要求能选择性地杀死肿瘤细胞，而不破坏正常脑组织的结构和功能。硼中子俘获治疗(boron neutron capture therapy，BNCT)从理论上能满足上述要求，预期成为一种理想的胶质瘤等恶性难治肿瘤的治疗方法。

BNCT兼有中子穿透力和重离子的杀伤力，能够同时歼灭分裂和不分裂的肿瘤细胞。有自适应定位能力，对肿瘤体周边组织无明显的辐射损伤。BNCT几乎集中所有针对恶性肿瘤放射性治疗的优点，特别适用于治疗脑胶质瘤(glioblastoma multiforme，GBM)[1，2]。我国 GBM 年发病率，据推测人数在3万～6万/年，多发于青壮年。BNCT为许多用传统方法无法治疗的肿瘤提供了一种新的治疗方法。

目前，由周永茂院士研发、凯佰特公司投资、中国原子能科学研究院设计建造的世界首台“医院中子照射器”已达临界投入运行，为开展BNCT研究提供了最重要的平台。“医院中子照射器”是一种基于微型反应堆的、在细胞尺度治疗癌症的新型核技术医疗器械。虽然该装置已于2009年12月临界，但是要达到进行BNCT的目标仍任重道远，其中包括对该装置中子特性(中子能谱、中子通量分布)的研究、含硼药物研究、中子辐射微剂量学研究以及必要的为临床准备的医学实践等。

BNCT方法的成功之处在于有足够的10B到达肿瘤细胞的同时，有很少的含硼药物到达健康组织。用适当的中子剂量照射目标组织，对肿瘤细胞产生的剂量应足够大，以使细胞中毒而又在正常组织的忍受范围之内。因此，准确地控制细胞中硼的宏观浓度在BNCT研究上非常重要。本实验对胶质瘤细胞对BPA的摄取和析出进行了相关的研究，为今后将要进行的BNCT细胞辐照实验提供了剂量计算的重要数据和实验依据。

2 实验材料及方法

2.1 实验材料

C6(大鼠脑胶质瘤)细胞系、U251(人脑胶质瘤)细胞系均购自北京协和细胞中心(Cell Resource Center)。新生Wistar大鼠购自北京芳元缘养殖场。BPA由美国俄亥俄州立大学杨伟廉教授惠赠，其结构见图1。

图1 BPA结构Fig.1 BPA structure

2.2 BPA－果糖溶液的配制

取 BPA 粉末 522.75 mg(2.5 mmol)，果糖450 mg(2.5 mmol)，溶于 80 mL 去离子水中，加入少许NaOH溶液加速溶解。待粉末完全溶解后，加HCl溶液，调节溶液pH 7.4左右。最后用去离子水定容100 mL。最终所得溶液 BPA浓度为2.5×10－5mol/mL，即10B 的浓度为 2.5 × 10－5mol/mL(250 μg/mL)。将溶液通过 0.2 μm 微孔滤膜过滤除菌，以备使用。

2.3 大鼠脑胶质细胞对BPA的摄取实验

2.3.1 大鼠胶质细胞的提取及培养

将出生1～2 d的新生Wistar大鼠脱颈处死，用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用Hanks液洗涤并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，用0.25%胰蛋白酶，37℃消化数分钟，用吸管反复吹打后过滤，离心(1000 r/min，3 min)，吸去上清，加入DMEM(dulbecco modified eagle medium)培养基制成细胞悬液。计数后按2×105mL接种于培养皿，并加入DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d更换培养液，10 d左右细胞铺满培养皿。

选用2 d的大鼠进行星形胶质细胞培养，而且培养皿没有经过多聚赖氨酸预处理(因为在没有多聚赖氨酸的情况下，神经元细胞贴壁能力非常弱)，可以最大程度地减少皮质神经元的污染。

2.3.2 实验方法

向培养皿中加入不同体积的BPA－果糖溶液，使 BPA 终浓度分别为 20、40、60、80、100 μg/mL。培养24 h后，用胰蛋白酶消化收集细胞，离心(1500 r/min，5 min)，弃上清，向待测样品中加入0.3 mL的70%高氯酸、0.6 mL的30%双氧水和5 μL的磷酸，然后用磁力恒温搅拌器升温到90℃左右，进行水浴加热2 h。加入生理盐水稀释定容至5 mL，保证稀释样品中的硼浓度大于感应耦合等离子体原子发射光谱仪(induced couple plasma－atomic emission spectroscopy，ICP －AES)的检测下限，用微孔滤膜过滤后，以未经含硼培养液孵育的样本调节零点，采用感应耦合等离子体原子发射光谱法测定溶液中硼的浓度，每组样本进行3次平行测量。

2.4 U251细胞系对BPA的摄取实验

2.4.1 U251 细胞的培养

U251细胞系为人脑胶质瘤细胞系。细胞置于MEM培养基中培养，其中含15%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，100 Ku/L的青霉素，100 mg/L的链霉素。培养条件:37℃，5%CO2/95% 空气，100%相对湿度下生长。2～3 d传代一次，倒置显微镜观察细胞形态，使细胞处于未分化的对数生长期。

2.4.2 实验方法

实验过程及ICP－AES样本的制备方法同2.3.2 节。

2.5 C6细胞系对BPA的摄取及析出实验

2.5.1 C6 细胞的培养

C6细胞系为大鼠脑胶质瘤细胞系。细胞在含5%胎牛血清(杭州四季青生物公司)、15%马血清(奥地利PAA公司)、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的F10培养基中，置于37℃的5%CO2孵箱中培养，保持饱和湿度。每2～3 d换液1次，待细胞增长至70%融合时，消化以1∶3分瓶传代。

2.5.2 C6细胞对BPA的摄取实验

实验过程及ICP－AES样本的制备方法同2.3.2 节。

2.6 室温下C6细胞对BPA的析出实验

将C6细胞培养在含BPA浓度分别为20、60、100 μg/mL的培养基中，24 h后，小心吸出培养液，以PBS液洗涤3遍，然后加入不含BPA的培养基在25℃条件下继续培养，并分别在换液后的1、2、3 h后，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃环境中消化1 min。加入常规培养液中止消化，将细胞悬液转移入离心管内，反复吹打形成单个细胞悬液，计数后，按上述方法制备样本，采用ICP－AES法测定溶液中硼的浓度，每组样本进行3次平行测量。

2.7 不同温度下C6细胞对BPA的析出实验

将C6细胞培养在含BPA浓度为60 μg/mL的培养基中，24 h后，小心吸出培养液，以PBS液洗涤3遍，然后加入不含 BPA的培养基，分别在4、25、37℃条件下继续培养，并分别在换液后的1、2、3 h后，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃环境中消化1 min。加入常规培养液中止消化，将细胞悬液转移入离心管内，反复吹打形成单个细胞悬液，计数后，按上述方法制备样本，采用ICP－AES法测定溶液中硼的浓度，每组样本进行3次平行测量。

3 实验结果和讨论

3.1 结果

3.1.1 3种细胞内硼含量随培养基中硼浓度的变化

3种细胞(C6，U251，大鼠胶质细胞)在含不同硼浓度(0、20、40、80、100 μg/mL)的培养基中培养24 h后，细胞内硼含量(μg/107cells)变化如图2所示。每个细胞内10B原子的数据见表1。

表13种细胞每个细胞内硼原子数随培养基中硼浓度的变化Table 1 Number changes of boron atom per cell in three kinds of cells with the boron concentration of the culture medium

由图2可见，随着培养基中BPA浓度的增加，3种细胞内的10B浓度均呈上升趋势。与两种胶质瘤细胞相比，大鼠胶质细胞内10B浓度变化较为平缓。并且，在不同培养基BPA浓度的培养条件下，两种胶质瘤细胞内的10B浓度显著高于胶质细胞(P＜0.01)，而两种胶质瘤细胞的硼浓度相互间无显著差异(P ＞0.05)。在培养基中BPA浓度分别为 20、40、80、100 μg/mL 的条件下，C6 细胞内的10B浓度与胶质细胞内的10B浓度之比为2.2、1.87、2.1、2.2、2.3;U251 细胞与胶质细胞内的10B 浓度之比为 1.8、1.7、2.2、2.2、2.3。

图23种细胞内硼含量随培养基中硼浓度的变化Fig.2 Boron content changes in three kinds of cells with the boron concentration of the culture medium

3.1.2 C6细胞在室温下对10B的析出

在室温(25℃)下，更换培养液后于不同的时间点(1、2、3h)检测 C6细胞内10B的含量(μg/107cells)，结果分别见图3和表2。

图325℃时C6细胞内10B的析出Fig.3 10B decrease in C6 cells in 25 ℃

由结果可见，C6细胞内10B浓度随培养时间的增加而逐渐减少。3 h后，当培养基中的BPA浓度分别为20、60、100 μg/mL 时，每个 C6 细胞内的10B原子个数(由表中结果计算可得)为7.1×109、11.3×109、15.5 × 109个/cell。利用指数衰减模型模拟曲线后，可得 BPA 浓度为 20、60、100 μg/mL 时，C6细胞的10B析出速率分别为(0.127±0.012)、(0.115 ±0.005)、(0.126 ±0.005)h－1，并无显著性差异，平均值为0.123 h－1。因此在室温(25℃)下，换液后C6细胞内10B浓度C(μg/107cells)可表示为:

C = C0× e－0.123t

式中，C0为细胞内初始10B浓度，可由培养基中BPA浓度得到;t为换液后的时间。

表225℃时C6细胞内10B的析出Table 2 10B decrease in C6 cells in 25℃

3.1.3 C6细胞在不同温度下对10B的析出

在不同温度(4、25、37℃)下，更换培养液后不同时间点(1、2、3 h)检测 C6细胞内10B的含量(μg/107cells)，结果分别见表3和图4。

由结果可见，更换培养液后，C6细胞内10B浓度随培养时间的增加而逐渐减少，并且不同温度下，10B析出速率不同，温度越高，速率越大。利用指数衰减模型模拟曲线后，可得温度为4、25、37℃时，C6细胞的10B析出速率分别为(0.021±0.002)、(0.115 ±0.005)、(0.328 ± 0.006)h－1。并且在37℃条件下，3 h后，每个C6细胞内10B原子个数为6.1 ×109个/cell。

表3 不同温度下C6细胞内10B的析出Table 3 10B decrease in C6 cells in different temperatures

图4 不同温度下C6细胞内10B的析出Fig.4 10B decrease in C6 cells in different temperatures

3.2 讨论

1936年，Locher首次提出BNCT治疗肿瘤的设想。此后，多国科学家利用不同的硼化合物和反应堆进行了一系列的实验研究。但早期的研究结果并不理想，其主要原因之一是硼化合物对肿瘤的亲和力不够强，10B不能富集到肿瘤内。经过不懈的探索，20世纪80年代后期，日本神户大学医学院的Yutaka及其同事合成了BPA，将其用于动物实验取得了较理想的效果[3]。

作为BNCT中使用的硼携带剂，应具备以下特点:选择性结合肿瘤细胞，最好能在瘤细胞内、尤其是细胞核内聚集;不论单独使用或与其他硼化合物结合使用，其浓度应达到每个瘤细胞内约109个10B原子，或每克肿瘤组织中10B含量为20～35 μg;肿瘤与正常组织浓度比达3∶1～4∶1;在照射治疗期间能在肿瘤组织中保持一定浓度;肿瘤中聚集的硼化物对人体无毒性[4]。有实验证明，当大鼠血脑屏障未被破坏时，BPA注射2.5 h后的肿瘤与血液浓度比为8.5，肿瘤与脑组织浓度比为5.9;当血脑屏障被破坏后，注射2.5 h后，肿瘤与血液BPA浓度比达10.9，肿瘤与脑组织浓度比可达 7.5[5]。在实验中，于含硼培养液中培养24 h后，C6和U251两种胶质瘤细胞与星形胶质细胞的硼浓度比平均为2.0和2.2，有显著性差异。虽然与文献报导的体内实验结果有些差距(这可能与肿瘤组织内某些特殊的微环境因素有关，体外实验不可能完全模拟体内的状况)，但此结果仍能说明BPA对胶质瘤细胞的高选择性。同时，在不同浓度含硼培养基中培养24 h后，两种胶质瘤细胞内的硼原子数均达到109个;在C6细胞的硼析出实验中，在析出速率最快(37℃)的条件下，3 h后，每个细胞内的硼原子数依然有109个，表明在实验所选择的BPA浓度跨度(20～100 μg/mL)，温度跨度(4～37 ℃)和时间跨度(1～3 h)下，BPA达到了BNCT所要求的每个瘤细胞内应有109个10B原子的最低要求。

BPA是一种酪氨酸前体类似物，其选择性作用机制尚不清楚。起初有人认为，BPA仅通过自由扩散进入瘤细胞内，也有学者表明了它与另一种含硼药物BSH相比，主动运输在细胞吸收BPA的过程中起到了重要作用[6，7]。有文献报导[3]，在一定浓度的含硼培养基中，随着孵育时间的延长，C6、SHG－44和BT－325三种胶质瘤细胞内BPA浓度逐渐增加，至24 h末仍有继续增加的趋势，而大鼠星形胶质细胞在孵育前12 h内逐渐上升，后12 h内浓度趋于稳定。这在一定程度上说明了除自由扩散外，尚有主动运输这一吸收方式的存在。BPA可能参与处于分裂细胞、尤其是胶质瘤细胞的生命活动。实验还表明，C6、SHG－44和BT－325三种胶质瘤细胞G2/M期与G0/G1期相比，硼含量均明显增高，说明有丝分裂的过程可以加速BPA的吸收，而主动运输也许就出现在有丝分裂过程中。同时，3种胶质瘤细胞与星形胶质细胞相比，G2/M期浓度均有显著提高，而且星形胶质细胞最终硼浓度趋向稳定，表明胶质瘤的有丝分裂过程与正常胶质细胞的差异性决定了对BPA的主动运输作用。G0/G1期的胶质瘤细胞内硼浓度与胶质细胞相比，浓度差异不如G2/M期明显，可能是因为这一期瘤细胞对BPA的吸收以自由扩散为主，而这一方式不依赖于细胞类型。并且，作为酪氨酸类似物，BPA应由细胞的L－氨基酸转运系统运输，在细胞内部不会产生代谢变化[8]。因此，在硼析出实验中，采用指数衰减模型模拟硼析出速率是合理的[9]。

实验采用的两种胶质瘤细胞系中，C6来源于大鼠，而U251为人源性。两种瘤细胞的生物学特性相近，对BPA的吸收作用也相近，这说明了BPA对胶质瘤作用的广泛适用性。

本项工作为以后将要进行的BNCT实验提供了建立10B浓度－细胞存活率数学模型，以及辐照过程中的剂量计算所需的基本数据。

为了从理论上建立相似的模型，有学者用蒙特卡罗模拟方法，通过微剂量学模型来计算高LET射线穿过核时的径迹，以期得到细胞或亚细胞水平上的吸收剂量及其生物学效应。然而，通过这种方法很难得到一个与实验结果相符的正确结论，因为在计算过程中，细胞的形态以及硼化合物在细胞内的分布都是假设值。在实际过程中，细胞的形态以及10B在细胞内的微观分布可能会随在照射过程中发生改变。这些因素对于BNCT的生物学效应的评估造成了很大的不确定性。与理论模型相反，笔者从实验结果中提取的数学模型，避免了相关的假设条件，很大程度上降低了不确定性，因而能更准确地评价硼中子俘获反应的生物学效应。

在建立此数学模型的过程中，由于是离体系统，因此细胞的外部环境一定要小心的调控，并保持恒定，特别是外界环境的温度条件，因为由硼析出实验的结果可知，温度对硼的析出速率有着较大的影响。

4 结语

实验进行了不同胶质瘤细胞系对10B的摄取及析出的实验研究，并建立了在本实验室条件下利用ICP－AES精确检测细胞内10B浓度的方法。实验结果表明，含硼药物BPA对不同的胶质瘤细胞系(U251，C6)有广泛的亲和力;并得到了在不同10B浓度和温度条件下胶质瘤细胞10B的析出速率，表明胶质瘤细胞的10B析出速率与温度之间存在依赖关系，即环境温度越高，析出速率越大，并建立了相应的计算细胞内10B浓度的数学模型。本项工作为以后将要进行的BNCT细胞实验提供了剂量计算，以及建立10B浓度－细胞存活率数学模型所需的基本数据。此模型避免了相关的假设条件，降低了系统的不确定性，可更准确地评价硼中子俘获反应的生物学效应。

但是，由于BNCT过程包含了复杂的物理和生物学因素，因此很难对于其生物学效应做出精确的评估。可以通过增加细胞内10B浓度，以及中子注量的方法来增强BNCT过程对肿瘤细胞的杀伤效果，但这也同样增加了对正常组织细胞的危害。因此，目前优化BNCT最有效的方法，仍然是加强含硼化合物对肿瘤的亲和力，最大限度地将10B浓聚于肿瘤细胞内。

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