根霉菌反应分离耦合生产有机酸的研究进展

陆君洁 ，万永军 ，付永前 ★

（1.台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000 2.台州金晟环保制品有限公司，浙江 仙居 317300）

0 引言

生物反应/分离耦合过程（Integrated Bioreaction-Seperation Process），被 A.Freeman［1］称为原位产物分离过程（In Situ Product Removal，简称ISPR），是兴起于二十世纪六十年代末的一项正在迅速发展的新技术，是指在生物反应发生的同时，选择一种合适的分离方法及时地将对生物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地从生产性细胞或生物催化剂周围原位移走。其优点突出表现在：①、在线分离出发酵产物可解除生物反应过程中普遍存在的产物抑制，提高反应速率；②、简化产物分离过程的投资和操作费用；③、易于实现生产全过程的连续化和自动化。

根霉菌（Rhizopus species）具有发酵产物光学纯度高、产酸能力强、营养要求简单、产物容易提纯等优点而被广泛应用于L-乳酸和富马酸的发酵生产中［2-4］。根霉菌并不是一种能耐受高酸度的微生物，因此在有机酸的发酵过程中进行有效的pH控制就显得非常重要。较常用的pH控制方法是添加碱性物质如各种碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物及氨水等，其中CaCO3是最常用的中和试剂。然而，使用CaCO3作中和试剂存在提取工艺流程长、消耗工业原料多以及回收率低，同时还会产生大量的废渣（CaSO4）和废水，环保压力较大，能耗高［5］。针对上述问题，科研工作者研究使用其他中和试剂来替代CaCO3，如Na2CO3、NaHCO3、Ca（OH）2、（NH4）2CO3以及 KOH 与 K2CO3的混合物等［6］，但采用这些中和剂时，有机酸的产量以及生产强度均比使用CaCO3做中和试剂时要低，其原因主要是可溶性的有机酸盐随着发酵的进行会表现出很强的抑制效应，严重阻碍了菌体的生长和产物的进一步生成［7］。基于以上原因，以反应/分离耦合过程为技术平台发酵生产包括富马酸、乳酸等在内的各种重要有机酸势必会成为日后有机酸生产行业研究的重点。

1 反应/分离耦合技术的概述

有机酸的发酵生产乃至其它生物化工过程中普遍存在着生产效率低、回收成本高等问题，经济可行性成为这些生物化工过程应用和进一步推广的主要障碍。其主要原因在于许多生物反应都存在着严重的产物抑制，造成生物反应过程的反应速率低、底物利用率低及反应体系中最终产物浓度低，加大了产品分离的难度和分离过程的投资和操作费用。可见，提高生产效率、降低回收成本的关键在于消除生物反应过程中存在的产物抑制，而解决的办法之一就是将生物反应与分离过程更加紧密而有机的结合，在生物反应进行的同时从反应体系中及时分离出抑制产物，正是基于这一思想，生物反应与分离耦合过程的研究方兴未艾，成为生物化工研究的热点之一［8］。

生物反应与分离耦合过程的研究最早兴起于六十年代末，当时的研究大多数是针对可挥发性初级代谢产物的生产体系，其中主要采用基于产物挥发性的分离方法如真空蒸发、气提等，进行产物的在线分离［9］，但这类产物的生产并不能充分体现耦合过程的优越性，同时这些工艺本身由于存在诸多缺陷而至今难以实现在工业生产上的推广与应用；进入八十年代以来，研究重心逐渐转移到非挥发性初级代谢产物的耦合过程上，在这一时期，耦合过程的工艺日趋成熟，形式也更趋多样化，相对于原位耦合过程而言，异位耦合过程引起了更大的重视；进入九十年代以后，发酵与分离耦合技术的应用面更趋广泛，分离手段更多，工艺更先进，应用体系已扩大到包括微生物次级代谢产物和蛋白质的发酵生产，动植物细胞培养等［10］。九十年代初期，根霉菌利用该技术发酵生产有机酸的研究开始引起研究者的关注，在将近20年的研究历程中，逐渐开发了基于萃取、膜分离、吸附等分离手段的根霉菌生产有机酸的反应分离耦合工艺。

2 根霉菌反应/分离耦合制备有机酸工艺的研究

根霉菌是一类典型的丝状真菌，传统的根霉菌发酵生产有机酸，多利用游离的米根霉菌丝在生物反应器中进行发酵，根霉菌的菌丝发达，在反应器中易形成大的菌丝团，引起氧气及其它营养物质的传递困难，或缠绕在搅拌桨上，使搅拌阻力增加，使得产物生成速率低、得率低、生产不稳定，因此，根霉菌的反应分离耦合体系一般较为复杂，要实现反应分离耦合技术在根霉菌生产有机酸的工业化应用，须从以下三个关键技术进行优化与集成：①、适于耦合体系根霉菌的固定化技术；②、适于耦合体系根霉菌发酵的生物反应器的研究；③、适于耦合体系的分离技术。

2.1 根霉菌固定化技术的研究

所谓固定化技术就是将生物催化剂限制在一定的空间范围内并保持所需的生物催化活性。细胞固定化方法有很多，Karel等将其归纳为四大类：表面附着、多孔介质包埋、隔离和自聚集。而使用根霉菌固定化主要集中于载体固定化［11］（凝胶包埋法、吸附法）和无载体自固定化（自聚集）技术的研究。

2.1.1 载体固定化

载体固定化技术即是将根霉菌菌体固定在不同载体材料上，在选用载体材料时，研究者大多数开始使用软凝胶，如海藻酸钙等。然而，根霉菌在固定化颗粒内部的分布并不像细菌和酵母那样均匀，同时，海藻酸钙在生产过程中，存在凝胶颗粒易发生破损、软化等问题，使得凝胶颗粒的稳定性和机械强度相对较差，不利于固定化细胞的多次利用；鉴于海藻酸钙的不足，有的学者使用对根霉菌具有吸附性的载体进行菌体固定化技术的研究。如Sun等［12］应用该技术固定化根霉菌在气升式反应器发酵与离子交换树脂分离生产乳酸，并建立了耦合模型。载体固定化所用载体范围很广，从天然惰性材料如粘土、氧化铝等，到人工合成的树脂、多层纤维、尼龙等网状织物，甚至一些天然生物质材料如各种植物的种子、玉米棒芯、蔗渣等。虽然用于米根霉固定化发酵生产有机酸的载体种类相对比较多，但是很少能优化出用于大规模生产并创造出良好的经济效益的载体规格，同时载体材料的使用随之带来了许多细胞生理、生态、工艺、工程和经济方面的问题，因此载体固定化米根霉发酵生产有机酸技术较难实现于大规模的工业化应用。

2.1.2 自固定化技术

自固定化技术是指利用某些具有较强自身絮凝能力的菌株形成颗粒，以此作为一种固定化细胞的方法。根霉菌具有较强的自吸附能力，在发酵液中能形成多种不同的菌体形态（球状、絮状及团块状等），其中球状菌体因其在传质传氧、产物分离及重复利用等方面的优势而成为根霉菌发酵产有机酸的首选。如：Fu等［13］成功实现了搅拌式反应器的逐级放大米根霉菌球形态控制工艺，可使菌丝体形成直径约1.2mm的小球。然而，目前鲜有利用自固定化根霉菌细胞反应分离耦合制备有机酸的文献报导，其主要是因为影响菌体生长形态的因素很多，包括：培养基组成、初始pH、接种物、培养温度、发酵罐形状、搅拌供气系统、培养方式、发酵液粘度等。如何稳定地获得形态均一、大小合适、活力强劲的自固定化细胞仍是当前需要攻克的技术难题。另外，由于种子培养过程的可分析参数较少，种子的内在质量难于控制，多是根据发酵的最终结果来判断，相对于发酵过程的研究而言，针对种子培养的系统优化还有待于进一步的研究。但是，自固定化根霉菌技术的实现，将有效解决丝状真菌发酵过程中形态控制难的问题，提高发酵过程的传质、传氧及传热效率，降低产物分离难度，强化生产强度，减少生产成本。

2.2 生物反应器的研究

利用生物催化剂进行反应的生物反应器，在生物过程中为细胞代谢提供了一个适宜的物理及化学环境，促使细胞更好生长，并得到更多的生物量或代谢产物，是实现生物技术产品工业化的关键设备。固定化细胞生物反应器大致可以分为嫌气型和通风型两大类［14］，嫌气型的有固定床、流化床、中空纤维膜反应器等，通风型的有搅拌式、气升式、转盘式等［15］。根据根霉菌好氧发酵的特点，研究者采用的生物反应器多采用通风型的气升式、转盘式和搅拌式等。

气升式生物反应器则以其结构简单、剪切力小、营养物质混合均匀、氧气供应充足而在根霉菌固定化发酵中显示出极大的优越性，据不完全统计，近70%的研究者都选用这种型式。但是该方式剪切力小、养料供应充足易造成固定化菌丝及游离菌丝的过度生长，以至充满整个发酵罐而使操作被迫停止；转盘式生物反应器已广泛应用于污水处理中，是生物膜法处理污水的重要装置之一。该固定化方法的特点是能使固定化菌体间歇的在空气和培养基之间转换。这种固定化的生物被膜可以重复利用两周以上而没有活力损失［16］，但该反应器在大规模的工业应用中有限制；搅拌罐因其搅拌浆产生的剪切力过大而使固定化菌丝易脱落，且游离菌丝易缠绕到搅拌浆上造成搅拌阻力增大，故不易适用于根霉菌的固定化发酵。但搅拌式发酵罐是目前生物发酵工业化生产最常用的反应器，少数研究者也在研究改进固定化材料的机械强度以及搅拌罐的结构，使其在霉菌固定化中使用。近年来，根霉菌自固定化技术不断取得突破，使得根霉菌利用搅拌式发酵罐生产有机酸成为可能，Fu等［17］在搅拌式发酵罐中研究了双阶段溶氧策略调控米根霉菌球发酵生产富马酸，富马酸转化率达到了54.2%。有理由相信，结合自固定化根霉菌在搅拌式发酵罐中工业化生产有机酸具有巨大的潜力。

2.3 分离技术研究

分离过程在生物化学工程中的重要性无论是技术上，还是经济上都要大大高于传统的化学工程。因此，发展和改进生物分离过程本身对整个生物化学工程的发展占有举足轻重的地位。而生物分离过程只有有效地与生物反应过程相配合、相协调，才能充分体现出其特色与先进性。目前在生物反应与分离耦合过程中常用的分离方法有：1）基于产物挥发性的方法；2）萃取法；3）膜分离法；4）固态化产物分离法。在乳酸、富马酸发酵与分离耦合过程中，由于这两种有机酸沸点较高且高温下易分解，因而不宜采用基于产物挥发性的方法，可应用的方法主要有：有机溶剂萃取法、膜分离法以及离子交换法。

有机溶剂萃取法是提取化工产品的重要方法，但是该方法存在着产物选择性差、对菌体有毒害等弊端，因此该技术的研究还主要集中于发酵结束后产物的提取，目前萃取有机酸所选用的萃取剂主要包括Alamine 336、Amberlite LA-2、三丙胺（TPO）+TOA，三辛胺（TOA）等。膜分离法是一门新兴的跨学科技术，有机酸提取工艺中研究较多的是电渗析法分离。然而，电渗析法提取有机酸存在膜易污染、生产成本高等问题，因此，以后的研究重心应放在降低仪器成本以及耦合体系如何高效耦合等问题上。离子交换树脂具有吸附容量大，吸附选择性强，易于工业化等特点，因此，在有机酸提取中倍受青睐。利用离子交换树脂对有机酸进行分离纯化的工艺已较为成熟，并已经实现了工业化的应用。进入二十世纪九十年代，针对有机酸反应分离耦合体系的离子交换分离工艺的研究也越来越引起人们的兴趣。如Fu等［18］以根霉菌反应分离耦合生产富马酸体系为研究对象，考察了树脂Amberlite IRA-400对富马酸的动态吸附，并得到了最优的吸附条件；同时考虑到发酵过程中葡萄糖对有机酸吸附的影响，付永前等［17］进一步深入研究了从葡萄糖-富马酸溶液中提取富马酸的离子交换工艺，并从6款碱性离子交换树脂筛选了一款树脂Amberlite IRA-400，最大吸附量为122mg/g，对葡萄糖吸附较少，利用该树脂参与富马酸的发酵，可以连续将发酵液中的富马酸分离出来，从而维持发酵所需的pH值，而葡萄糖则返回发酵罐继续参与发酵，从而能实现富马酸的连续发酵。

2.4 根霉菌反应分离耦合生产有机酸耦合工艺的研究

根霉菌反应分离耦合生产有机酸工艺就是将以上三个关键技术进行集成与优化。对现有耦合工艺进行总结发现，目前，耦合过程中根霉菌的固定化还主要采用载体固定化技术，反应器也多集中于膜转盘式反应器，分离技术采用了有机溶剂萃取、电渗析与离子交换技术。虽然该工艺路线报导较少，但利用该工艺生产有机酸，有机酸的生产强度显著提高。

3 小结与展望

近二十年来，利用根霉菌合成L-乳酸和富马酸的研究已经取得了较大的进展，乳酸以及富马酸的发酵水平成倍增长，但进入二十一世纪以来，有机酸的生产却面临着发酵水平有限，生产成本高；存在环境污染，同时物耗、能耗较大两大瓶颈问题。综合耦合体系中各个技术的研究现状，笔者建议今后耦合体系应从以下几个方面入手进一步开展研究工作，以解决耦合工艺中存在的问题，实现根霉菌发酵分离耦合生产有机酸的工业化生产：1）适于耦合体系根霉菌自固定化技术的研究；2）适于耦合体系的生物反应器的研究；3）适于耦合体系的分离工艺的研究；4）耦合体系集成的研究。

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