朊病毒病治疗的研究进展

张珠明，汪仁莉，赵德明

（1.宁夏大学农学院动物科学系，宁夏 银川750021；2.中国农业大学动物医学院 国家动物海绵状脑病实验室，北京 海淀100193）

世界卫生组织曾预言，到2040年，最常见的致死性疾病中，神经退行性疾病将会攀升至第二位，仅次于癌症。在这类疾病中，朊病毒病是惟一能通过动物模型直接探寻体内病理学机理的一种。朊病毒病是由朊病毒引起人和动物出现以中枢神经系统退行性病变为特征的一类疾病，主要包括人的库鲁病、克雅氏病、致死性家族性失眠，牛的海绵状脑病、绵羊和山羊的痒病、鹿科动物的慢性消耗性疾病等等。目前认为该类疾病的病原朊病毒是一种不含核酸的蛋白颗粒，是机体内正常朊蛋白PrPC发生构象转化错误折叠形成的异常朊蛋白PrPSc。朊病毒在形态上是一种蛋白聚集物，感染机体后，不能被体内的蛋白酶消化清除，也不会引起机体的免疫反应和炎症反应，因此不易早期发现和进行治疗。多年来，研究朊病毒病的科学家们一直致力于该病的发病机制和治疗方面的研究，希望通过体外或体内试验找出抑制朊病毒转化、增殖或转移的方法，但仍然没有一种药物足够有效地预防和治疗这类疾病。朊病毒在机体内复制的分子基础是PrPC与PrPSc间构象转化，故而阻断PrPC向着PrPSc转化是朊病毒病治疗的一个切入点。此外，朊病毒病主要特征是朊病毒在中枢神经系统聚集，引起患病个体脑组织的病理变化，因此，减少PrPSc的蓄积也是治疗过程中经常考虑到的另外一个方面。故而，用于治疗的药物如果能够突破血脑屏障（brain－blood barrier，BBB）进入中枢神经系统（centre nerves system，CNS），或者直接将药物引入到脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）或脑组织，从这两个方面入手都有可能起到延缓疾病发生的作用。目前为止，在朊病毒病的治疗方面取得的进展主要有以下几点。

1 化学治疗

化学治疗常常使用一些具有抗朊病毒作用的化合物，包括聚阴离子化合物硫酸肝素、粘多糖以及粘多糖类似物刚果红、四环类化合物（如四环素，强力霉素）、多烯类抗生素（如两性霉素B）、阻断β－折叠形成的多肽类（如小鼠或仓鼠的朊蛋白多肽PrP119－136）等［1］。环己二胺四乙酸二钙钠能通过螯合感染 M1000的Balb／c小鼠脑内的 Mn2＋进而减少PrPSc的含量［2］。羟乙基哌嗪乙硫磺酸的体外试验中，对感染朊病毒的细胞有明显地抑制PrPSc的蓄积作用，而且这种抑制有浓度依赖性［3］。

这些抗朊病毒的化合物在体外选择性地与PrPC或PrPSc靶向结合，或靶向作用于PrPC→PrPSc的转化过程，阻止PrPC转化成PrPSc，从而抑制了朊病毒的增殖。然而，这些物质在体外培养接种朊病毒的细胞模型中有效，有的且对动物模型有毒性，或在体内治疗效率极低，甚至无效［4］。

2 LRP／LR受体特异性抗体治疗

至今发现的朊蛋白细胞表面受体有很多种，近年来，朊蛋白37－kDa／67－kDa层粘连蛋白受体及其前体（LRP／LR）备受关注，体外证明该受体是朊病毒分子PrPSc在细胞内复制和聚集所必需的蛋白。因此，在理论上利用LRP／LR的特异性抗体与LRP／LR蛋白特异性结合可以抑制或者阻断PrPSc在细胞内的聚集。体外试验已证明Anti－LRP／LR抗体W3可以抑制PrPSc在感染痒病病毒的神经细胞ScN2a内的聚集［5］；在体内试验中，将 LRP／LR的重组单链抗体片段（single chain antibodies，scFV）注射免疫C57BL／6小鼠后，降低了PrPSc在外周组织内的增殖，且明显延长了小鼠的临床发病潜伏期［6］。利用基因工程的方法，将表达LRP／LR抗体scFV的基因克隆到改造的腺病毒（adeno－associated virus，AAV）基因内，然后将组装成的AAV扩增子经脑内注射到C57BL／6小鼠的海马，使LRP／LR的抗体scFV基因在体内得到表达。产生的LRP／LR抗体scFV与层粘连蛋白的特异性结合能够抑制PrPSc在小鼠外周组织细胞内的复制和增殖，延长了小鼠的临床发病潜伏期，而且在该小鼠脾脏内也检测到了AAV基因［7］。这表明朊蛋白特异性受体LRP／LR抗体的应用可以作为朊病毒病治疗的一种手段。此外，以腺病毒基因作为载体运载的表达LRP／LR的抗体scFV的基因能够在机体各组织中分布，且能产生有效的主动免疫抗体，也可以作为朊病毒病的一种潜在治疗方法。

3 RNA干扰

RNA干扰是翻译后修饰水平上沉默内源性基因最有力的技术。在几种神经退行性疾病的动物模型中已经表现出治疗的潜力。慢病毒介导的抗PrP的shRNA的表达有效地抑制了朊病毒的复制延长了痒病感染小鼠的存活时间［8］。慢病毒载体介导的LRP／LR基因特异的干扰siRNA脑内注射痒病毒株RML感染的LC57BL／6小鼠后，也能够延长小鼠的临床发病潜伏期［9］。RNA干扰已成为神经类疾病极有效的治疗方法。

4 免疫治疗

朊病毒不能引起机体内产生主动免疫抗血清，因此不能够利用疫苗来治疗。最早提出的朊病毒病抗体治疗方法是基于1988年的一项体外研究：体外感染痒病病毒的细胞与抗PrP抗体孵育一段时间后降低了该细胞的传染性［10］。已有研究发现，PrP抗体在体外培养的细胞模型和动物模型体内都可以降低朊病毒的感染性。PrP抗体以及重组的抗原结合片段（antigen－binding fragment，Fab）可以抑制朊病毒在ScN2a细胞内的复制和增殖。抗PrP中间片段的抗体（PrP90－110，132－156）不仅可以有效抑制痒病病毒感染细胞，还能降低感染鼠脾脏内的PrPSc［11］。RML朊病毒株感染的小鼠如果在早期就应用单克隆抗体ICSM35（PrP143－153）和ICSM18（PrP93－105）进行干预，能够减弱发病状况，并且没有副作用［12］。

抗体治疗方法已经成为朊病毒病治疗研究的一个挑战。大量体外试验研究已经证明，PrP抗体具有抗朊病毒效果，但是在动物体内进行应用时，还要考虑抗体分子大小、抗体给予途径、抗体在机体内的扩散性等因素。

4.1 不同类型的抗体 在动物模型体内，直接注射抗PrP全长的抗体分子可以降低朊病毒感染性，但是由于全长抗体IgG分子量很大，不易穿过血管进入组织，尤其难以穿过BBB，进入脑组织。此外，机体内存在复杂的生物级联反应对抗体的应用也造成了一定的困扰，例如，研究发现脑内注射抗PrP的IgG抗体之后，IgG与PrPC的交联作用在体内造成了海马神经元和小脑神经元的死亡［13］。而且由于全长抗体在机体内扩散性能较差，如果用以治疗朊病毒病，只有在外周感染的同时或感染之后立即注射抗体，才能够阻止朊病毒从外周组织转移到CNS，在一定程度上抑制其致病性。基于全长抗体分子较大，有人又研究出了单价小分子抗体片段Fab，但是Fab也不易穿过BBB。因此，全长的抗体和Fab都不宜直接注射到动物体内，以产生被动免疫来预防和治疗朊病毒病。另外还有一种可变区的scFV，这是一种单价小抗体，只含抗体的重链和轻链的可变区，两个可变区之间由一段融合多肽连接。这种抗体保留了抗原结合特异性，且应用基因工程的手段能够使scFV在细胞内表达并被分泌到细胞外。Campana等人分别利用重组的病毒基因载体AAV和慢病毒将重组的朊蛋白抗体D18scFV转染到ScN2a细胞和scGT1细胞内，结果AAV－D18scFV和慢病毒－D18scFV都降低了细胞内PrPSc的量［14］。

4.2 抗体在机体内的扩散性 动物机体通过直接注射的抗体能够获得被动免疫，该类抗体在机体内的扩散性不好，通常难以穿过血管进入到机体各组织，尤其难以进入CNS。因而，抗体能够在机体内扩散是抗体治疗朊病毒病的关键条件。全长抗体和Fab在体内的扩散性不好，而病毒基因载体运输scFV的方法能够产生较好的扩散性，如改造的AAV、HSV或lentivirus可以携带scFV抗体基因在机体组织内扩散，并能够穿过BBB。与IgG和Fab相比，scFV抗体具有更广泛的应用价值。Wuertzer等人利用重组的AAV2作为病毒载体运输D18scFV抗体到朊病易感小鼠的CNS内，同时外周接种感染朊病毒，明显延迟了小鼠的临床发病潜伏期，且免疫组化和Western blot结果显示CNS内PrPSc的量降低［15］。值得注意的是，应用病毒载体使朊病毒抗体进入到脑组织内的方法并不可能完全阻止朊病毒感染，因为传染性朊病毒的复制主要发生在外周淋巴组织内，PrPSc仍然能够在外周组织内复制，并可能通过神经入侵的方式从外周组织转移到CNS。由于PrPC→PrPSc的蛋白结构转化过程还未完全弄清楚，对于抗体治疗方法，要找到确切的、能够特异性阻断朊病毒增殖的抗体，并且要使抗体能够在机体组织内扩散，穿过BBB在CNS内扩散，还需要大量的科学试验来不断研究和探索。

4.3 抗体的被动免疫和主动免疫 直接给动物注射抗体用以治疗朊病毒病时，要生产大量的单抗，而生产单抗对生物学技术的要求较高，且需要大量的经费。因此，为了研究出一种真正具有可行性的治疗方法，科学家们结合被动免疫和主动免疫，研究出了一种由病毒基因载体运载的靶向结合PrP抗体的治疗方法，该方法中将朊病特异抗体的单价小抗体分子scFV基因克隆到病毒载体如AAV、慢病毒或单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），然后经病毒包被将组装成的病毒扩增子注射到动物体内，使scFV抗体在动物机体内长期表达，并保持其免疫特异性。这种方法产生的scFV特异抗体能够被分泌到细胞外，且能从注射部位扩散到机体其他部位，并穿过BBB在CNS内扩散，达到了主动免疫治疗目的，克服了前面提到的被动免疫扩散性差的弊端。此外，病毒基因作为载体运输抗体基因已成为一种有前景的治疗手段，用于治疗多种神经退行性疾病，如利用HSV基因载体治疗帕金森病。

综上所述，科学家已经在朊病毒病治疗方面的研究上做了很多努力，这些发现开创了朊病毒病和其他神经退行性疾病治疗领域的一个新途径。虽然取得了一定的成果，但很多结论都是基于试验动物模型得到，至今仍未发现能应用于市场的有效药物或治疗方法。因此，仍然需要科学的不断创新和探索，继续研究PrPC→PrPSc的转化过程，PrPSc的转运和清除作用，这样才能够在朊病毒病治疗上有更大的突破。

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