蜂胶抗氧化作用研究进展

王姗姗 王 捷 杨文超 吴珍红 缪晓青

（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和枝条上采集的树脂状分泌物并混入蜜蜂上颚腺分泌液和蜂蜡等而形成的复杂物质。[1]蜂胶含有约300余种复杂成分，其中包括40～50种黄酮类物质及各种萜烯类、有机酸、醌类、氨基酸、维生素、酶类、多糖和矿物元素等[2]。现已从蜂胶中分离出黄酮、黄酮醇类化合物就有30多种。另外，蜂胶还含有硒、锌、铁、锰、铜、镁、钙等多种人体必须的微量元素及多种维生素。

机体的氧化反应中部分氧产生过氧化氢、超氧化阴离子和自由基羟基等活性氧及自由基，过剩的自由基作用细胞膜及血液中的酯类物质，形成脂质过氧化物，沉积在细胞膜上，使膜功能丧失，细胞活力下降。蜂胶的抗氧化作用的研究越来越引起关注。蜂胶中含有丰富的黄酮类、甙类、酚类、萜烯类化合物，具有很好的抗氧化性能，是公认的天然抗氧化剂，同时还能显著提高人体内的SOD活性，因而能稳定和清除自由基，减少脂质过氧化物和脂褐素的生成与沉积，保护细胞膜，增强细胞活力，调节器官组织功能，有效延缓衰老，并避免人体患某些癌症、心脏病等其它与年龄有关的疾病。因此，服用蜂胶是补充天然抗氧化剂的一种有效途径。

1 蜂胶的功能作用

蜂胶具有很好的药用及保健功能，主要有以下几点：

1.1 蜂胶的护肤作用

蜂胶和它的主要的多酚成份显示了高的抗氧化活性，如发现其具有抑制亚油酸（LA）的脂质过氧化的作用。而且，通过测量防晒系数，证明这些物质对广谱对紫外线A和紫外线B具有光保护功效，通用指示剂为紫外线B，通过对UVA / UVB的比率、临界波长测量得出了紫外线吸收性能。蜂胶的醇提物及其成份显示了很好的抗氧化能力。这两个特点的结合使蜂胶醇提物成为可能的防晒霜商业配方的活性成份，因为它们的防护和预防性质。有学者研究发现：威尼托蜂胶和其中的某些成份，因为有着显著的抗氧化性能结合良好的广谱UVB和UNA保护，可以有效地使用于天然防晒霜中[3]。

1.2 抗氧化与保护心脑血管

蜂胶是公认的天然抗氧化剂，其中的芦丁、桷皮素、维生素E、维生素C及微量元素锌、硒等物质，具有极强的抗氧作用。它能增加机体自由基的清除能力、阻止自由基的氧化损伤作用[4]。

1.3 增强免疫功能

蜂胶能提高人体的体液免疫和细胞免疫功能。研究证明，蜂胶能显著增强巨噬细胞的吞噬能力和自然杀伤细胞的活性，能促进机体产生更多的抗体。临床研究证明，老年人在服用蜂胶提取物后，抗体合成能力和免疫细胞的吞噬性明显提高。

1.4 抑菌、抗病毒

蜂胶具有广谱抗菌作用。蜂胶提取物可使用细菌溶菌死亡。蜂胶还是天然抗病毒物质，对多种病毒均有较强的抑制作用。

1.5 预防肿瘤

蜂胶中含有丰富的抗癌物质。研究证明，癌症患者在服用蜂胶后，可缩小癌细胞且能减轻化疗、放疗引起的副作用。

1.6 其它作用

蜂胶除了具有上述的保健作用外，还有抗过敏、抗炎、抗疲劳、降血压、调节血脂、改善代谢等作用。

总之，蜂胶对人体健康十分有益且无毒副作用，蜂胶被誉为“神奇的小药库”、“健康的保护神”，是21世纪人类保健的新宠儿。

2 蜂胶的抗氧化作用机理

蜂胶中的黄酮类化合物、咖啡酸酯类以及其他一些成分是主要的抗氧化物质，主要研究结果如下：

2.1 黄酮类化合物的抗氧化机理

蜂胶中黄酮类化合物与超氧阴离子反应，阻止自由基反应的引发，或与铁离子螯合阻止羟基自由基的生成，或与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过[5]。

2.2 蜂胶中咖啡酸酯类的抗氧化作用机理

咖啡酸苯乙酯（CAPE）是蜂胶提取液中的活性成分之一，能在微摩尔的浓度范围内抑制5-脂加氧酶催化的亚油酸和花生四烯酸的氧化过程。在10μM浓度时，可完全阻断人的噬中性粒细胞反应性氧化物的产生和黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶系统[6]。

2.3 蜂胶中其他物质的抗氧化作用机理

Basnetp等从巴西蜂胶的水提取物中分离出一种苯基丙烯酸衍生物的化合物，其抗氧化活性强于维生素C和维生素E。蜂胶水提取物还可以保护纤维细胞免受高压氧的胁迫，使得蜂胶水提取物具有抗炎症作用。德国学者Volpert研究发现，蜂胶的水提取物对心肌黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶催化的氧化反应均有抑制作用，对吲哚乙酸的过氧化反应也有抑制作用，其抗氧化作用可能与所含的单酚和多酚化合物有关[7]。蜂胶的抗氧化作用不仅仅来源于黄酮类化合物，其它成分也起一定的作用。

3 蜂胶抗氧化活性的测定方法研究

3.1 循环伏安法测定

用循环伏安法测定蜂胶提取物的总抗氧化活性。所有提取物溶液和标准化合物都50%甲醇制备。所有溶液在制备好后立即分析，物质吸附到电极表面最少时浸入铂电极并记录电极反应。浓度范围为5～50 ug/ml 的抗坏血酸溶液的循环伏安图作标准。我们用的蜂胶浓度范围是20～250 ug/ml。

为了提高精确性，工作电极用0.05 uM的氧化铝涂胶抛光，每个循环后用去离子水超声清洗。伏安图中电极波浪曲线下的总电荷(峰区)用曲线拟合的方法估算。这种方法测得的样品和对照物质抗氧化活性的电极波浪曲线下的总电荷是相关的。结果用mg抗坏血酸当量/g干物质量表示。从每一图表或测量值的电极波浪曲线下的总电荷减去背景信号的总电荷。

3.2 清除羟自由基能力测定法

对羟自由基清除能力的测定采用Fenton试剂(过氧化氢和硫酸亚铁)，原理是以过氧化氢为氧化剂以Fe2＋为催化体系，所产生的经自由基与结晶紫作用后使体系吸光度降低，利用吸光度值的变化间接测定所产生的羟自由基。

3.3 清除氧自由基能力测定法

清除氧自由基能力的测定主要利用某些体系如在氧化过程中有超氧阴离子自由基(O2-)的生成，O2-与某些化合物作用，产生有特定吸收波长的有色物质，利用分光光度计测定。蜂胶若能清除O2-，则吸光度发生变化，就能间接判断蜂胶对超氧阴离子自由基(O2-)的清除作用。邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生O2-，O2-又加速邻苯三酚自氧化速率，同时产生有色中间物质。有色中间产物的积累在滞后30～45 s与时间呈线性关系，一般维持4 min左右，随后减慢。有色中间产物在325 nm处有强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于O2-的浓度，消除O2-则抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价蜂胶清除O2-的能力。

3.4 β-胡萝卜素-亚油酸法

β-胡萝卜素变色是广泛使用的抗氧化分析方法主要评价的是蜂胶在乳化脂质体系中的抗氧化能力，因为β-胡萝卜素对由自由基介导的氧化反应极度的敏感。β-胡萝卜素分子结构中有11个共扼双键，是一种多烯色素，在470 nm处有吸收峰，它易被氧化而褪去颜色。亚油酸酯的自氧化速度是油酸酪的10～40倍，更容易形成自由基。在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物能使β-胡萝卜素褪色，随时间的延长，吸光度值越来越小。β-胡萝卜素退色的程度与体系中物质的抗氧化活性的强弱有关，抗氧化能力越强，吸光度值下降越慢。在评价蜂胶的抗氧化活性中，胡萝卜素变色法也是常用的方法。

3.5 清除DPPH自由基法

评价蜂胶的抗氧化活性常采用清除DPPH自由基方法。DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。DPPH自由基已被广泛用于测试各种样品的自由基清除活性。利用清除DPPH自由基方法评价抗氧化活性方法简单，因而被广泛用于抗氧化活性筛选。但DPPH方法存在的不足是，DPPH既是氧化剂又是自由基指示剂，当被测物与DPPH紫外吸收有交叠时，会影响测定结果。此外，DPPH的颜色虽然主要因单电子转移反应消除，但也可以由氢转移反应消除。由于空间位阻决定反应的倾向，因此小分子化合物由于更接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。许多在体内与过氧自由基发生快速反应的抗氧化剂可能因空间位阻等原因不易与DPPH自由基反应。同时，该方法的线性范围也相对较窄。

3.6 ABTS阳离子脱色法

ABTS[2，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]阳离子脱色试验是一种广泛用于评估各种物质抗氧化活性的分光光度分析法。ABTS阳离子自由基的产生是通过ABTS原液与过硫酸钾在室温黑暗中反应12～16 h而完成的。在供氢抗氧化剂出现的情况下，ABTS阳离子自由基将会减少。与其它几种总抗氧化能力体外测定法相比，ABTS法快速、简便，与抗氧化剂的生物活性相关性强。但ABTS法本质上是一种间接方法，是用来检测物质清除ABTS。这种自由基的能力，与真实的氧化分解没有关系，它只是用TEAC值来表征测试样品与经氧化得到的ABTS反应的能力而非阻断该氧化过程，TEAC值在概念上类似于阻断系数，并不是直接反应被检物质的活力，所以要想较全面的判断一种物质的抗氧化能力还要结合其它的方法。

3.7 FRAP法

铁还原抗氧化能力测试(FRAP法)评价蜂胶的抗氧化性原理为：Fe3+-三吡啶三吖嗪(TFTZ)可被蜂胶样品中还原性物质还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并于593 nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算蜂胶抗氧化活性的强弱。FRAP反应属于单电子转移反应，测定样品离子还原能力与大多数抗氧化剂介导的自由基熄灭反应有很大不同。因此，FRAP方法不能测定那些通过熄灭自由基(氢转移反应)起作用的物质，尤其是琉基和蛋白。该方法的另一缺陷是很多物质发生氧化还原反应的时间比较长，所以选择不同的反应时间终点对结果影响很大。

3.8 ORAC法

氧化自由基吸收能力测定法(0RAC法)是目前抗氧化研究领域中备受关注的一种新的评价方法。该方法以偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源，Sodium Fluorescein为荧光指示剂，维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析，可用来测定样品清除ROO·、·OH等自由基的能力。该方法的专属性、线性、精密度、准确度及重复性等与其它抗氧化能力分析方法相比具有诸多显著的优点，但是该法的自动化程序需要昂贵的全自动生化分析仪，而手工操作程序费时费力，所以较难在国内一般实验室推广应用。

4 蜂胶抗氧化活性的影响因素

4.1 蜂胶的种类、采集时间

蜂胶中各种化合物的含量随着产地、采集的时间、树种等因素的不同而变化。玄红专等研究了不同产地蜂胶的抗氧化活性，结果发现：产自阿根廷、澳大利亚、中国、匈牙利以及新西兰的蜂胶醇提取液具有很强的抗氧化活性，并且抗氧化活性与其总酚酸类及黄酮类含量相关，其中主要的抗氧化组分为堪菲醇和咖啡酸苯乙酯[8]。Sforcin et al研究发现，季节对蜂胶的抗微生物活性及免疫特性没有很大影响。但是在测定一年中按月收集的巴西蜂胶时发现，其抗氧化活性及酚类总含量都有很大不同。这一观察结果和伊斯拉实验室的研究结果一直，同时chen也发表说蜂胶的抗氧化活性和它收集的季节有关。此外，以前的报道表明，季节对蜂胶的化学组成不会有很大影响，但是会影响蜂胶化学成分的量[9]。

Elena Gregoris等对4个采自威尼斯不同地形、人口密度地区的蜂胶样品，通过分析脂质过氧化抑制作用来评估蜂胶的抗氧化活性，确定蜂胶中决定其抗氧化活性的类黄酮和咖啡酸衍生物等多酚类物质，通过Folin-Ciocalteu试剂、酶、DPPH清除、TEAC-like检测、蜂胶的图谱特征测定验证抗氧化活性和多酚类物质之间的关系，验证每一主要成分的化学结构与抗氧化性的相关性。结果发现：用脂质过氧化抑制作用能力表达的蜂胶乙醇提取物抗氧化活性很高，其值与相同量的儿茶素类似；研究的酚类物质都有较高的抗氧化性，它们的苯环结构上都有两个orto 羟基集团 (咖啡酸衍生物、槲皮素、儿茶素)。分子中苯环上仅有一个羟基集团（芹菜素、柚皮素）或两个meta 羟基集团（松鼠素、白杨素）化合物的抗氧化性较小(脂质过氧化抑制作用低于30%)，没有两个orto 羟基集团的高良姜素、山奈酚的抗氧化性归因于羟基连接在苯环C2-C3共轭双键的C3上[10]。

4.2 蜂胶中黄酮类化合物的分子结构

蜂胶中黄酮类化合物的种类很多，但并不是所有的都具有抗氧化活性，只有分子结构满足一定的条件时才能表现出较强的作用，其中最主要的是羟基化程度和羟基的位置，且一般认为且一般认为B环中的邻-二羟基起着主要作用。分子中酚羟基的数目或位置不同，彼此间的极性也不同，利用这一特性可以选择适当极性的溶剂系统来提取抗氧化活性较高的成分。有研究表明乙醇浓度不同时对蜂胶抗氧化组分的提取率是相同的。

4.3 提取方法

蜂胶可以以粗胶、水提取物和醇提取物的形式被使用，有研究者认为蜂胶的水提取物比醇提取物抗氧化效果好，且主要是由于其中咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量高，其抗氧化活性也是由于这些成分能够清除自由基，因而能阻止体内嗜中性白细胞产生活性氧自由基和限制由超氧阴离子导致的过氧化脂质的过量增加[7，11-12]。蜂胶水提取物多用于研究蜂胶对人体的医疗作用；作为食品添加剂研究和使用时多采用蜂胶的醇提取物。吉挺等研究了不同提取方法下蜂胶的抗氧化活性发现不同提取方法下蜂胶的抗氧化活性存在着差异，而醇提超临界残渣具有较好的抗氧化效果，有望开发利用[13]。Rajibul Arif Laskar[14]等研究了印度蜂胶的抗氧化活性及其化学成分发现：在所有的这些实验中，水提取物活性明显高于乙醇提取物，这与先前其他地区蜂胶的报道相矛盾。这可能是由于它的高酚含量。因此水提取可能成为蜂胶有机溶剂萃取的替代品。此外，两种黄酮、松属素(1)和高良姜黄素(2)能从乙醇提取物中分离，而且高良姜黄素(2)有很高的DPPH自由基清除活性。因此，印度蜂胶作为一种富含天然抗氧剂的资源，可用于预防各种与自由基有关的疾病。

4.4 蜂胶的浓度

在一定范围内，蜂胶的抗氧化活性随着蜂胶浓度的增加而增强。主要是因为蜂胶浓度增加时，抗氧化成分的浓度随之增加，抗氧化活性在一定程度上得到增强。

4.5 作用的物质

蜂胶对不同物质的抗氧化活性存在着差异，蜂胶已广泛的应用于肉类和果蔬产品的保鲜，对不同的产品有不同的使用量和使用方法。蜂胶可以显著延长猪油、油炸核桃仁和色拉酱等高脂肪高营养食品的酸败，明显延长脂肪氧化酸败的诱导期。在猪油上使用时，其抗氧化效果显著好于相同量的没食子酸丙酯；在用蜂胶处理核桃仁时，其抗氧化效果是相同浓度二丁基羟基甲苯（BHT）的1.8倍。同时,采用先浸泡后油炸的方法比先油炸后浸泡的方法处理核桃仁更能充分发挥蜂胶的抗氧化作用[15]。

5 结论与展望

蜂产品具有很好的医疗与保健作用。蜂蜜在有些地方已作为药用产品使用，并且有了一些产品如药蜜。蜂毒也被制成制剂用于风湿等疾病的治疗。对于蜂胶的产品也有一定的开发，如蜂胶口喷剂，用于消炎等作用；还有蜂胶香皂等的产品。蜂胶的抗氧化作用还没得到很好的开发，蜂胶作为食品抗氧化剂还有待于开发，一方面是蜂胶抗氧化剂的成本会相对较高，二是蜂胶抗氧化剂的制作工艺还有待开发，三是蜂胶作为药用产品的研究还不是很多。我们要充分开发利用蜂胶的抗氧化性，这对于医疗保健、食品、化妆品等行业具有重要的意义。

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