禽肺病毒研究进展

孙石开，刘 闯，鲁俊鹏，宋永峰，覃健萍

（广东温氏食品集团有限公司技术中心禽病室，广东新兴 527439）

禽肺病毒（Avian pneumovirus，APV）在上世纪70年代于南非首先分离到，随后研究证实APV存在A、B、C、D 4个亚型。APV可以感染多种禽类，可导致感染动物鼻气管炎、肿头征、产蛋下降等疾病，给禽类养殖造成严重的危害。目前已经建立了一套成熟的APV检测系统，但由于APV在感染的宿主体内存活的时间很短，而且主要出现在疾病的早期，这给病毒的分离了很大的困难。目前，对APV致病机理和防制还缺乏足够的认识。因此，本文主要从APV病原学、病原检测和分离、致病机理、防控等方面的研究介绍目前对APV研究的进展。

1 病原学

APV又称为火鸡鼻气管炎病毒（Turkey rhinotracheitis virus，TRTV），属于副粘病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为单股负链RNA病毒，可以引起火鸡和一些其他禽类上呼吸道疾病。APV感染首先于上世纪70年代报道于南非，最初只发现火鸡发病，但后来证明在鸡群中也有发生。APV已被证实参与多病原混合感染的疾病过程，使疾病感染变得非常复杂，导致出现高发病率和不同情况的死亡率。APV感染可导致产蛋禽类在生产期出现严重的产蛋下降[1]。APV在世界许多区域已成为禽类养殖的严重威胁，目前只有澳大利亚没有APV感染的报道。

1.1 APV株分型 最初认为APV只有一个血清型，两个基因亚型（A和B），通过核苷酸序列分析和单克隆抗体分析可以有效将两个基因型区分开。上世纪90年代末，又分别从在美国和法国鉴定了两种不同的新型APV株（C型和D型），由此认为APV至少存在4种以上基因型或者更多的血清型[2]。1999年，Toquin在法国从番鸭体内分离出一株APV，血清学和基因分析发现该病毒分离株与C型APV关系非常密切[3]。

1.2 APV基因组 APV基因组包含了8个主要的结构蛋白基因，基因组全长约为13.4 kb，8个基因从3'端到5'端排列顺序为N-P-M-F-M 2-SH-G-L。C型APV F蛋白与A型和B型F蛋白基因之间的氨基酸序列同源性约为72%，而A型和B型APV F蛋白之间的同源性为83%左右。相似的，C型M蛋白与A型和B型之间的氨基酸同源性约为78%，低于A型和B型M蛋白之间89%的同源性。N蛋白在A型和B型之间的同源性为89%，远高于C型与两者之间的同源性[4]。APV G蛋白在A、B、D型病毒株之间的同源性小于40%。而C型G基因仍没有相关的报道。APV株不同亚型在不同基因之间的亚型多态性差异研究并不完整，仍有待进一步完善。在最近20多年间分离自欧洲的B型APV F蛋白和G蛋白（与其对应的基因）在B型病毒株之间的同源性大于98%，这表明所有的病毒株中的F和G蛋白均具有共同的起源，同时也表明两个蛋白变异的幅度非常小[2]。

2 流行病学及危害

火鸡和鸡是APV的主要易感动物，此外也有报道鸭、野鸡、珍珠鸡、鸵鸟、鹅等其他禽类也可感染APV，有些禽类虽然不表现明显的临床和病理改变，但可出现种禽产蛋量下降。野鸟和海鸥可能是该病毒传播的重要载体。APV的爆发存在着明显的季节性，主要集中在候鸟迁徙的春季和秋季。尽管感染不同禽类的APV株之间存在着一些差异，但有报道指出某些基因型的APV可以同时感染不同的禽类[2]。APV可能主要通过空气媒介传播，机体的排泄物具有传播APV的可能性。尽管有报道在感染APV的火鸡输卵管中检测到病原存在，但APV能否通过蛋进行垂直传播还有待进一步证实。

感染禽类常因为继发感染出现严重的病理变化，火鸡死亡率不超过2%，而发病率可以超过10%以上，对产蛋火鸡生产效率具有明显影响。鸡的易感群的死亡率可到15%，产蛋鸡的产蛋量可下降40%。APV感染鸭主要表现为产蛋鸭的产蛋量下降，下降的幅度主要根据伴随继发感染的病原而呈现不同的变化[3]。

3 致病机理

APV感染引起的疾病症状往往是一种继发感染造成的。APV已被证实参与多病原混合感染的疾病过程，并与其他的病原协同导致机体疾病的加剧。诸如肿头病，机体头部肿大是直接由致病性的大肠杆菌造成的。Marien证实火鸡感染APV后，对鼻气管鸟杆菌感染机体起协同作用，加剧呼吸症状的出现[5]。最近的研究表明APV与鹦鹉热衣原体有着密切的联系，实验结果表明感染鹦鹉热衣原体的机体常常伴随有APV的感染，APV可以加剧鹦鹉热衣原体造成的呼吸道症状[6]。比较单独免疫APV疫苗与免疫传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗后再免疫APV后发现，IBV可干扰APV的复制，导致APV检测出的时间更晚、检测难度更大[2]。

研究表明敲除APV M2、SH、G基因可破坏APV病毒复制和免疫原性，尤其SH基因[7-8]。研究还发现，L基因第4 200位核苷酸突变可以导致病毒的毒力增强，同时促使突变病毒能够获得适应更高温度条件的能力[9]。Luo等证实F蛋白在不同亚型的APV株间并不存在交叉抗原性[10]。Silke等还证明APV在火鸡和鸡群中存在不同的致病力和传播途径，在病毒感染期间两物种体内的局部或者系统免疫反应都呈现了不同的变化[11]。病毒的感染可抑制脾细胞和胸腺细胞的有丝分裂，上调IFN-γ和IL10在鼻甲组织的表达[12]。

4 APV感染的检测

4.1 病原检测

4.1.1 电镜检测当使用负染色电镜法检测不同细胞中培养的APV时，常常可以看到形态多样、直径在20 nm～500 nm的囊膜病毒颗粒，病毒颗粒常呈球形，但也会出现超过1 000 nm的纤维状形式。直径为14 nm的螺旋形式的核衣壳与病毒囊膜存在7 nm的间距。病毒颗粒的表面紧密地包裹着一层大约15 nm边缘突起[2]。

4.1.2 免疫组化检测通过免疫组织化学方法，目前已经清楚APV抗原在呼吸道的分布。该方法中的免疫过氧化物酶（Immunoperoxidase，IP）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）、免疫金染色法（Immunogold staining method）等技术已经被应用于检测火鸡和鸡体内的APV抗原，IP与IF相比具有许多的优点，但仅仅就检测APV抗原而言，IF也是非常有效的一种方法[2]。3种主要的免疫组化方法中，IP和IF应用最为广泛。

4.1.3 RT-PCR检测RT-PCR已经被广泛地应用与APV的病原检测中，设计鉴别不同亚型APV的RT-PCR比设计通用型RT-PCR简单得多。但将亚型特异性RT-PCR作为首选的检测技术会导致当有新型APV存在的时候常常被忽略掉，D型APV就是在法国存在超过15年后才被认识到的。因此，B¨ayon建议以保守的N基因作为靶序列，首先设计APV通用的RT-PCR检测体系。然后，再以G基因为靶基因设计亚型特异性RT-PCR检测体系[2]。有研究者比较了直接从干棉签抽提的RNA与湿棉签和沉淀物中取下的细胞抽提的RNA，两种方法均能成功的检测到APV。比较感染APV鸡的口腔棉签、食管棉签、鼻气管棉签发现，3种棉签中都能检测到相似滴度的病毒，但感染弱毒APV禽类除外。感染弱毒APV的禽类没有流涕症状，使用RT-PCR只能在少数的感染动物的鼻气管棉签中检测到病毒的存在[2]。RT-PCR被广泛的应用于APV的分子流行病学调查的研究中。Kwon等使用荧光定量RT-PCR对流行于韩国的APV进行了检测，分析发现所有的病毒分离株均属于B型APV[13]。Ongor等采用RT-PCR对出现症状和临床表现健康的鸡群进行APV分子流行病学调查，结果发现，出现症状的鸡群几乎全部检测为阳性，而健康鸡群中仅有2.9%的阳性率[14]。

4.2 抗体的检测 APV可诱导火鸡和鸡体内产生抗体反应，抗体滴度检测可以反映疫苗免疫和野毒感染后机体的反应。目前已经发展了多种用以检测APV抗体的技术，比如IF（用以检测血清中和抗体）和ELISA。

4.2.1 免疫荧光检测间接免疫荧光已经应用于APV的抗体检测中。有学者使用感染了APV的气管环检测采集自人工感染APV和自然感染APV的火鸡血清样品，结果表明两种血清与APV的反应都具有特异性和敏感性。O'Loan使用生长在盖玻片中感染了APV的Vero细胞作为抗原来源，成功在英国出现火鸡鼻气管炎之前检测到了北爱尔兰商品火鸡和鸡群体内的APV抗体，但使用双抗夹心生物素-亲和素ELISA却无法检测到这样的结果[15]。

4.2.2 中和抗体试验中和抗体检测（SN）主要用于检测APV的感染。中和抗体试验可应用于各种培养系统，包括气管环培养（TOC）、组织培养（CEF、CEL、MA104或者Vero）。当使用TOC时，纤毛的脱落是作为病毒感染的指示器，但由于APV需要很长时间才能完全导致纤毛脱落。而这一系统最主要的缺点是当应用C型APV时，观察不到纤毛的脱落，因为该型病毒不能引起纤毛的病变。相比之下，如果使用细胞培养，细胞病变（CPE）则是病毒存在的主要指示，在产生CPE之前也需要在细胞上有一个适应的过程。不过，这个过程需要的时间往往只比TOC上的中和试验少一些[2]。在中和抗体试验中采用96孔平板细胞培养则简化了中和抗体试验。

4.2.3 ELISA检测ELISA是目前用于APV检测最为常用的方法，市场上已经有很多商品化的检测试剂盒出售。大多数ELISA采用间接型和阻断型ELISA。理论上，间接的方法会更敏感，但阻断ELISA因为不依赖于任何禽类特异性的结合物而更适合作为各种禽类血清学的检测工具。大多数间接ELISA采用酶联免疫球蛋白，但生物素-亲和素ELISA比传统的间接ELISA更敏感[2]。

选择什么样的APV株作为ELISA检测用的抗原是非常重要的。研究发现，使用3种不同APV株作为包被抗原检测血清抗体时，并不是所有包被的抗原都能够与血清抗体结合，这一发现在中和试验中更为显著。这一点提示运用EILSA检测方法时应根据当地流行的病毒株情况选择合适的抗原最为检测原，否则可能错过发现APV早期感染的诊断时机。有研究比较了3种商品化的ELISA检测试剂盒，结果发现在检测同一样品时敏感性和特异性都存在很大的差异性[2]。因此，明智的选择是使用同源性的抗原作为包被抗原。

4.2.4 抗体检测方法的比较Baxter-Jones等比较了IF、ELISA和SN在CEF或者CEL培养体系中检测自然感染APV火鸡群抗体滴度的效能差异。结果发现APV感染早期3种方法检测的结果非常相似。IF和SN在感染第5 d、ELISA在第13 d监测到机体APV抗体量的减少，直到感染后第34 d仍能够在机体内检测到抗体的存在。不过从检测的速度和性能限制分析，ELISA无疑是APV抗体检测的最佳选择。尽管如此，因为可以直接观察到CPE，SN试验则可以更为简单、直观、快速的检测APV。SN试验在CEF和CEL中检测APV抗体并没有太大的联系，前者能获得更为稳定的抗体检测滴度[2]。Toquin等比较了ELISA和SN试验检测4种不同亚型的结果，发现ELISA在区分不同亚型方面比SN试验更为有效[16]。

5 病毒分离

采用IF、IP、PCR等技术虽然可以检测到病毒的存在，但这些技术无法获得活病毒颗粒。深入的鉴定或者进行流行病学研究，还需要进行病毒分离。

5.1 病毒分离的时间选择 APV可以在人工感染火鸡和鸡后1 d后从感染的机体内分离到病毒，滴度的增长一直持续到感染后5 d，病毒滴度在感染后3 d～5 d达到峰值。之后体内病毒量急剧下降，感染后10 d～14 d后，体内APV几乎完全消失了。因此，病毒的分离必须在疾病临床症状的早前期，如果错过这个时间，一旦出现明显的症状时存在于机体内的病毒量将非常低[17]。成功进行病毒分离最好的选择是检测确定最初动物感染舍后其毗邻、病毒感染可能发生的养殖舍内的动物。

5.2 病毒分离材料的选择 许多研究都证实大多数APV在火鸡和鸡体内主要在鼻气管组织，少量存在于肺脏和肺泡中。因此，分离APV的材料一般选择鼻甲骨、鼻窦、气管组织或者棉签[12]。Cook等比较了人工感染APV后以采自病毒感染动物鼻腔、口腔、咽部的棉签作为病毒分离材料的有效性时发现，3个部位使用强毒接种后，所分泌的病毒量是相似的。而当使用弱毒接种时，只有少量鼻部分泌物排泄，同时也只能检测到微量的APV[2]。因此，只有当有效的收集到各部位的分泌物时才能够用于检测和分离病毒。

5.3 病毒分离方法 首先在南非从火鸡中分离到APV的Buys是使用感染病毒肉鸡的窦内分泌物的过滤液接种SPF雏鸡，4 d后从接种鸡的鼻腔内分离到了APV[18]。通过类似的方法，McDougall等先将自然感染APV出现临床症状的火鸡呼吸道组织匀浆化，然后稀释过滤，最后以过滤液接种SPF火鸡。随后他们在接种后3 d，制备了这些感染火鸡的气管环，观察环内纤毛的脱落情况，分离出了APV[19]。Picault则是通过收集感染病鸡的呼吸道组织，匀浆过滤后接种到SPF火鸡体内，随后从出现了临床症状的火鸡中分离到病毒[2]。

从之前在临床材料中成功分离的APV分析，大多选择卵黄囊接种法或者TOC进行病原分离。使用卵黄囊法接种6日龄的鸡胚，一般在接种大约8 d后收集尿囊液和卵黄囊，再持续传代2代～3代后可以观察到鸡胚出现出血或者死亡。此时可将蛋胚液收集并接种于细胞中培养增殖，如Vero细胞或鸡胚成纤维细胞（CEF）。当使用气管环分离病毒时，一般首先将临床病料在TOC中间隔3 d～4 d盲传4代，可在接毒后5 d～7d观察到纤毛脱落，而最高的病毒滴度出现在接毒后的4 d～5 d。尽管之前南非病毒株和美国病毒株都通过卵黄囊接种分离到，但一般更倾向于使用气管环进行病毒分离。不过美国分离的APV并不引起气管环纤毛脱落。当病毒在其中一个系统中分离出时，便可以很容易适应在各种细胞中生长，例如CEF、CEL、Vero[2]。Patnayak等比较了APV疫苗毒在 BGM-70、MA-104、QT-35、BHK-21、M cCoy、DF-1 和原代火鸡CEF中的增殖情况，发现BGM-70、MA-104中APV的滴度要比对照中的Vero细胞更高。除此之外，其他细胞也都能很好的适应APV的培养[20]。也有研究显示APV在鸡胚相关细胞系（CER）也具有在Vero细胞中相似的复制能力[13]。目前已有报道使用CEF从人工感染APV的火鸡体内分离到病毒。Goyal等采用QT-35细胞原代分离C亚型APV，但需要连续盲传5代～7代[21]。在组织培养系统中连续传代APV可能致弱病毒。相比APV在气管环中连续传代超过100代后，病毒毒力仍然没有任何变化[2]。无论使用哪一种系统分离APV，必须保证APV在其增殖过程中不同检测方法检测APV结果的一致性。

6 防控

目前还没有有效的治疗手段，加强饲养管理和卫生安全防控是广泛的预防措施。Garmyn等研究发现恩诺沙星对APV与鼻气管鸟杆菌的混合感染具有一定的治疗效果[22]。雏禽、肉禽等生长阶段的禽体主要使用活疫苗进行免疫，而种禽，特别是开产种禽主要以灭活苗免疫。不同亚型的疫苗具有交叉保护性，报道证实，针对A和B型的疫苗可以很好保护C和D型APV感染的动物[16]。Cha等采用C型APV弱毒苗进行鸡胚免疫，雏火鸡孵出后攻毒强毒APV，结果胚胎免疫的火鸡可以获得完全保护[12]。此外，种鸡免疫灭活苗时辅以（Poly∶IC）也可以使免疫动物获得完全的保护的效果，并显著降低野毒在宿主体内的复制滴度[23]。通过滴鼻、喷雾、饮水的方法免疫APV疫苗的雏鸡发现，喷雾和饮水方式免疫的雏鸡比通过滴鼻方式免疫的雏鸡获得更高的保护力[24]。但也有研究发现，T细胞可抑制A型APV弱毒疫苗的免疫反应，导致在田间免疫中会出现高低不同的疫苗免疫的效果[25]。Ongor等研究发现，流行B型野毒APV的区域，A型APV疫苗免疫的鸡群中出现呼吸症状的比例要比免疫B型APV疫苗的鸡群低[14]。此外研究还发现APV疫苗免疫也可以促使野毒抗原性改变而导致免疫失败的[26]。因此，Dennis等运用特异性针对APV的抗体治疗APV感染鸡，结果显示感染鸡成功获得了保护[27]。

7 小结

总体而言，早期APV抗原和抗体的检测对防制APV感染非常重要，建立完整的检测体系、开展APV流行病学监控，可以不断深化对APV流行规律的了解，进行有效地防控，减少禽类养殖业的损失。此外，APV病毒的分离方法的建立对于开展流行病学和深入研究APV的致病机理极其重要，因此探索更为完备的APV病原分离技术显得尤为关键。尽管目前已经有许多成功分离和检测APV的案例，但总体上而言对APV的认识还非常少。例如，水禽、候鸟等动物在APV传播过程中作用是什么？与APV有协同作用的病原有那些？它们是如何协同使机体致病的？因此，不断开展对APV的研究则显得非常有意义。

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