转Bt基因抗虫棉毒蛋白检测方法及其表达规律研究进展

贺 文，陈金湘

(湖南农业大学农学院，长沙410128)

棉花是重要的经济作物和纺织工业的重要原料，发展棉花产业，对提高棉农经济收入、发展纺织工业和改善人们衣着水平有着密切关系［1］。虫害是制约棉花高产、稳产的重要因素，常规化学药剂防治虫害的同时，使棉虫产生抗性，同时污染了生态环境，增加生产成本。20世纪80年代生物工程技术飞速发展，为培育抗病虫性强、纤维品质优、产量高的杂交棉品种提供了技术保障，尤其是培育成功的转Bt基因棉——其表达产生的δ－内毒素具有对鳞翅目等目标昆虫毒力高、专一性强、且在棉株体内修饰后表达水平高等优点，促使转Bt基因棉成为世界上转基因植物大规模商业化种植的主要作物之一，取得了巨大的经济效益和社会效益。深入研究转Bt基因在棉株各组织、器官中Bt毒蛋白的表达量及抗虫特点，旨在揭示转Bt基因棉Bt毒蛋白表达含量的基本规律及明确对目标害虫毒杀性，为转Bt基因棉品种(组合)的选育、繁殖、推广和安全评价管理提供科学的依据［2］。

1 Bt毒蛋白检测方法

1.1 酶联免疫吸附法(ELISA)

酶联免疫吸附法(ELISA)因其操作相对简便、快速和检测灵敏度高等优点而被广泛研究和应用［3］。该方法主要是基于抗原、抗体特异性结合以及标记酶的高效催化原理而建立的检测微量蛋白的方法。ELISA检测方法可分为:直接ELISA、间接ELISA、双抗夹心法［4］。该项技术需要固定相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶作用底物等3种试剂。其免疫分析过程为:首先将抗原(Antigen)或抗体(Antibody)结合到固相载体里，待测溶液中的特殊抗原或抗体结合到固相载体表面后，使酶标记抗球蛋白与抗体或抗原化合物结合，结合物通过酶标记物和底物颜色的改变而被检测，通过最后溶液颜色深浅进行定量测定(溶液颜色的深浅与原待测中的抗原与抗体的量成正比例)，从而应用吸光度值根据标准曲线的线性关系计算抗原(抗体)的量。

1.2 蛋白质印迹法(Western Bloting)

蛋白质印迹被广泛应用于检测蛋白水平的表达。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(非共价键形式吸附蛋白质)上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。通常有两种:毛细管印迹法和电泳印迹法［5］。其一般步骤为:1)蛋白样品的制备;2)SDS－PAGE电泳;3)转膜(PVDF或NC膜)与显色。

1.3 免疫试纸条法

免疫层析试纸条技术是20世纪80年代初发展起来的基于免疫学方法的快速检测技术，其原理是基于抗原抗体反应来检测待检物，结构主要包括样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、检测线(T线)、质控线(C线)、吸水垫及黏性底板等几个部分组成。依据其免疫层析反应时抗原与抗体结合方式的不同，免疫层析试纸条主要分为两类:双抗夹心免疫层析法和竞争免疫层析法［6］。

1.4 生物测定

生物测定法是目前最为广泛采用的鉴定方法，其原理是利用不同昆虫对毒蛋白的不同敏感性或者同一昆虫的不同死亡率来进行的，抗虫性分级标准依据束春娥［7］等的分级标准，棉花植株的抗虫性以棉铃虫的实际死亡率和校正死亡率表示，计算方法分别为:棉铃虫幼虫实际死亡率=死虫数/(死虫数+活虫数)×100%;棉铃虫幼虫校正死亡率=(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100%。高抗表现为幼虫校正死亡率＞80%，叶片被害呈Ⅰ级，活幼虫1～2龄;中抗则表现为幼虫校正死亡率60% ～79%，叶片被害呈Ⅱ级，活幼虫2龄;低抗表现为幼虫校正死亡率＜59%，叶片被害呈Ⅲ级，活幼虫2～3龄。

2 转Bt基因棉花毒蛋白表达规律及其影响因素

自转Bt基因棉问世以来，国内外研究人员通过免疫化学测定法、生物测定法等对转Bt基因棉花不同组织、器官的毒蛋白变化进行研究，发现Bt毒蛋白在所有检测到的器官中均有表达，转Bt基因棉花Bt毒蛋白含量及其对棉铃虫的抗性均呈明显的时空动态变化。

2.1 空间动态变化规律

转Bt基因棉花发育的同一阶段不同组织、器官中Bt毒蛋白含量、抗虫性不一致，并随着棉株发育而变化，但总体表现为:营养器官Bt毒蛋白的含量和杀虫活性均高于生殖器官。王保民等［8］经过测定，发现棉花叶片中的Bt毒蛋白含量显著性高于蕾、花、铃，果枝叶中Bt毒蛋白含量的变化规律与主茎叶基本相同。赵奎军等［9］研究发现，转Bt抗虫基因棉GK－12品系相同部位叶片的杀虫活性随着棉花生育期推移呈下降的趋势，尤其在盛花期之后显著降低;不同器官杀虫活性的顺序为:叶＞蕾＞铃＞花。孙伟等［10］用抗体夹心ELISA技术测定，Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高，蕾期次之，花铃期最低。Sivasupramaniam S等［11］用酶联免疫法分别测定转 Cry1Ac、Cry2Ab2棉 株 各 个 组 织 Cry1Ac、Cry2Ab2毒蛋白含量，结果表明转Cry1Ac毒蛋白表达量在顶叶中最高，在完全叶、花萼、苞叶中较低，但转Cry2Ab2毒蛋白表达量在幼铃中最高，完全叶、花萼、苞叶中较低。

2.2 时间动态变化规律

随着时间的变化，转Bt棉花整个生育阶段棉花的各个组织、器官中Bt毒蛋白的含量和抗虫性都有较大的差异，测定的结果也不尽相同，但总体表现为棉株生育前期植株生长旺盛，其Bt毒蛋白表达量高、杀虫活性强;随着棉株生长发育的推移，其Bt毒蛋白表达量显著下降，其杀虫活性急剧降低。陈松等［12］发现随着棉花生长发育进程的推进，Bt毒蛋白在叶片中的表达强度逐渐减弱，其中以苗期叶片中最高，蕾期次之，花铃期最低。李汝忠、沈法富［13］的研究表明，Bt毒蛋白的表达强度从苗期到蕾期呈上升趋势，至蕾期达到高峰，以后逐渐减弱。陈鹏等［14］采用ELISA法(酶链免疫法)研究和分析了单价(Bt)转基因抗虫棉及双价(Bt/CpTI)转基因抗虫棉不同生育期以及花铃期不同器官的杀虫蛋白含量，发现在时间分布上，各生育期顶尖平展叶表现为:初花期＞蕾期、花铃期＞苗期＞吐絮期。周晓梅等［15］用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac 平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常规对照品系(苏棉12)不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量，发现两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势，花铃期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为4.43、2.93 μg/g)和吐絮期(3.87 和 2.86 μg/g)的含量分别降至苗期第 6叶(7.64、8.38 μg/g)的58%、35%和51%、34%;相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶，前两者均为后两者的两倍以上。Chen F等［16］试验证明了棉花不同生育阶段有不同的Bt毒蛋白表达量;通过提升田间CO2浓度含量可以促使转Bt基因棉花生物量增加，但会导致Bt外源毒素表达含量减少;通过对出苗后45 d和90 d棉株茎、嫩枝毒蛋白测定，发现随着棉花生物量显著增加，Bt毒蛋白表达量减少，但是对出苗后90 d Bt棉叶和铃检测，发现其Bt毒蛋白无显著性变化。Guo WZ等［17］通过测定棉株不同生育时期主茎上叶片毒蛋白含量和抗虫鉴定，随着棉株生育期推移，Bt毒蛋白含量呈下降趋势，其对棉铃幼虫毒杀率也逐渐降低。Bird LJ等［18］通过温室测定后发现，转Cry1Ac棉表达毒蛋白在出苗15周后其毒蛋白表达含量与出苗4周相比降低了75%，不足10%的棉铃幼虫发育到了第五代，而室内转 Cry1Ac棉株上棉铃成虫存活率为62%，F1代棉铃幼虫存活率为39%。

2.3 影响转Bt基因Bt毒蛋白表达及抗虫性的因素

转Bt基因Bt毒蛋白表达及抗虫性具有时空特异性，这表明转Bt基因棉花中Bt毒蛋白的表达受棉株体内发育调控和外界环境条件影响。其原因有以下几个方面:1)外源基因在转基因植物中表达水平受表达载体的影响，启动子起关键作用，不同来源的启动子在不同基因中的表达效率有明显差异。目前，在棉花Bt抗虫基因研究过程中，广泛使用的35S启动子来源于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)蛋白基因，此启动子在棉株体细胞内具有很强的转录活性，可以在棉株不同时期器官、组织内表达对目标害虫毒杀的蛋白，但不是特定阶段表达型或虫害侵害诱导表达型，随着棉花生长生育后期棉株体内表达毒蛋白显著性下降，抗虫性变差。2)植物体内转入目的基因表现“沉默”现象已达成共识，转Bt基因在棉株体内的沉默可能与甲基化、转基因的拷贝数、插入受体裹包体位点及与受体中有同源基因等有关，使其表达水平低、不稳定［29］。3)Bt毒蛋白的表达水平受降水、光强、温度、栽培方式等条件影响，在低光强、高温下棉株生长旺盛时，抗性增加，反之则降低。降水也能够降低Bt杀虫蛋白的毒性表达［29］。4)棉花本身特定的次生物(棉酚为代表的萜烯类化合物和单宁类化合物)也会对棉铃虫的生长和发育产生影响，研究发现棉花缩合单宁和Bt毒蛋白之间有一定的拮抗作用，Bt杀虫蛋白表达会影响到棉花中缩合单宁的合成［30］。5)通过植物介导的RNAi(RNA interference)技术能够有效下调目标昆虫体内特异基因的表达，从而使转基因植株表现出抵御害虫的能力;将棉铃虫生长代谢有关基因CYP6AE14特异的 dsRNA(double－stranded RNA)导入植物中表达，并用转基因植物组织喂食棉铃虫幼虫，发现幼虫体内CYP6AE14的表达水平降低，幼虫的生长得到抑制［31，32］。

3 问题与展望

目前直接测定转Bt基因抗虫棉株内Bt毒蛋白的方法主要有酶联免疫法(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫试纸条法、生物试法。酶联免疫法(ELISA)具有高特异性、灵敏性，检测值可至ng～pg水平，但需特异性的抗体，且容易出现假阳性。免疫印迹具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，能对蛋白进行定性和半定量分析，但操作步骤繁琐，且实验过程中须有良好的内参体系，否则实验结果有偏差。免疫试纸条法检测快速，操作简便，价格低廉，适用快速检测及诊断，但灵敏度偏低，要求采用纯度高、亲和力强的单克隆抗体以及新型发射光谱型标记物并配合试纸条荧光读取仪，才能提高免疫层析试纸条的灵敏度。有些转基因棉株中Bt毒蛋白的表达量极低，甚至用ELISA和蛋白质印迹法都难以测定，而且生物试验结果仍表现出对敏感昆虫的抗性。测定过程中需统一虫源、虫龄，且试验占用空间大，测定所需时间长，昆虫饲养过程中易被病毒感染。鉴于全球转基因植物商业化迅猛发展，建立一种快速、高效、低成本、灵敏性强的转基因产品检测法将成为今后研究的发展趋势。

目前，转Bt基因棉花中Bt毒蛋白表达的研究尚处于初级阶段，研究人员对转Bt基因棉Bt毒蛋白含量的表达变化及抗虫性测定结果存在一定的差异，在今后的研究中，应进一步深入开展对外源基因在转基因植株中的动态表达机理，以及Bt毒蛋白表达水平与棉株体内次生代谢产物之间关系和害虫对Bt不同基因类型产生毒蛋白交叉抗性的研究，并结合运用“避难所”策略和天敌的协同作用，发挥转Bt基因抗虫棉毒蛋白对目标害虫防治的最佳效应。

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