治疗用生物大分子免疫原性的研究进展

薛秀霞

(利津县食品药品监督管理局，山东利津257400)

治疗用生物大分子，包括多肽、蛋白、酶、激素、单克隆抗体等，因其具有独特的药理作用而成为当今医药研究领域的热点，近年来相关的研究报道和上市产品也急剧增多，为生命科学的发展，尤其是癌症、慢性疾病的治疗带来了新的希望。但是，这些生物大分子作为机体的外源性物质，不可避免地会激活机体自身的免疫反应，比如形成针对药物的抗体、激活T细胞或内源性免疫反应等，从而减小药物疗效，甚至可能产生危及生命的毒副作用。如何合理地预测、减小及检测治疗用生物大分子的免疫原性是相关研究人员普遍关注的问题。本文从影响因素、改善措施、检测手段等方面对生物大分子的免疫原性进行综述，以期对相关研究有所帮助。

1 影响生物大分子免疫原性的因素

影响生物大分子免疫原性的因素有很多，按照产生的原因可分为患者相关、给药相关及药物相关的因素［1］。

1.1 患者因素 患者因素包括调节免疫应答的遗传因素、免疫缺陷相关的遗传因素和年龄。患者的遗传因素可以改变机体对药物的免疫反应，基因的多态性可能会影响机体与生物大分子的相互作用，从而引起免疫相关的毒副作用［2］。健康的个体对天然蛋白具有一定的耐受性，同时能够识别自身蛋白，但是免疫缺陷患者对这些蛋白可能缺乏正常的免疫耐受性，从而更有可能产生药物相关的抗体［3］。另外，对用于儿童或老年患者的生物大分子来说，考虑到儿童免疫系统尚未发育成熟、老年患者免疫系统衰退的可能性，用药时必须进行相应的免疫原性的测定。

1.2 给药因素 给药因素主要包括联合用药、给药途径、给药剂量及给药持续时间等。当生物大分子药物与其他药物同时使用时，不能根据单个药物使用时免疫原性的大小来推断联合用药时出现免疫原性的可能性。此外，给药方式对生物大分子的免疫原性也会产生一定的影响，与静脉注射相比，皮下和肌肉注射更容易发生免疫反应，一般认为是由皮下或肌肉组织中存在较多的抗原递呈细胞引起的，也可能是药物在局部滞留时间较长的缘故［1］。

1.3 药物因素 药物因素是引起机体免疫原性的主要因素，生物大分子的序列差异、糖基化作用［4］、制备工艺等都会对其免疫原性产生影响［5～7］。对于非人源性生物大分子药物，人体往往会产生较强的免疫原性，而且这种免疫原性一般会随着蛋白同源性的减小而增强。蛋白的糖基化作用被认为是一种减小免疫原性的方法。Karpusas等［8］将IFN－β糖基化后免疫原性有所降低，Gribben等［9］对rhGM－CSF进行糖基化后也得到了类似的结果，推测可能是糖基侧链遮蔽了生物大分子产生免疫原性的活性位点，但是Ilchmann等［10］将卵清蛋白糖基化后却增加了它的T细胞免疫原性，其原因有待进一步考证。为得到高纯度、稳定性好、安全、有效的蛋白产品，生物制品的生产一般要历时数月，包括宿主细胞的培养、原始细胞库的建立及蛋白的生产、纯化、分析、制剂、储存等过程，这些过程中任何微小的改变都有可能改变药物的有效性、毒性及免疫原性。生物大分子在生产过程中要经过诸多复杂的步骤，每一步都有可能导致最终所得大分子的结构的改变，蛋白在降解过程中可能产生具有更强免疫原性的抗原决定簇，从而增加其免疫原性;曾有报道无免疫原性的人血白蛋白作为干扰素α－2a的辅料时会导致蛋白的聚集及蛋白制剂的免疫原性的增加。此外，生物大分子生产过程中采用的容器也可能影响蛋白的免疫原性，玻璃容器的表面、气液界面、润滑剂等可以介导蛋白的变性，而塑料和橡胶中的邻苯二甲酸酯可能会导致变应原性的产生和免疫原性的增加。

2 减小生物大分子免疫原性的方法

治疗用生物大分子引起的免疫原性不仅会减弱药物的疗效，而且有可能产生毒副作用，甚至危及生命，因此有必要采取一定的措施降低此类药物的免疫原性。现有的减小生物大分子免疫原性的方法有:增加蛋白的人源序列，改善蛋白溶解特性，去除抗体表位，PEG化，鉴别和去除Ⅱ类MHC配位等。

2.1 增加人源序列 为减小鼠源生物大分子存在的人抗鼠抗体反应，人们采用的方法有:以鼠的活性区和人的恒定区制备嵌合抗体，将鼠的互补决定区(CDR)接到人类抗体的骨架上制备人化抗体以及通过噬菌体展示技术或转基因技术制备完全的人类抗体。这几种方法往往可以极大地减小生物大分子的免疫原性［11］。但是，即使是人类抗体也不能完全避免生物大分子类药物免疫原性的产生，仅仅通过增加人源化序列还远远不够。

2.2 改善溶解特性 蛋白的聚集体往往比蛋白本身的免疫原性要大得多，因此使蛋白聚合最小化、改善其溶解性可以有效地降低蛋白药物的免疫原性，一般认为蛋白的溶解性问题可以通过优化表达、纯化、制剂、溶解的条件来解决，但是与聚集相关的免疫原性问题有时却相当棘手［11］。

2.3 去除抗体表位 去除抗体表位是较为理想的方法，抗体表位一般位于蛋白表面的少数几个不连续位点上，仅仅几个残基就有可能具有很强的抗体结合亲和力，对这些抗体表位的关键残基进行修饰可减小其亲和力。例如，通过去除B细胞表位可有效减小非人源蛋白引起的免疫原性，靶向于CD22和CD25的免疫毒素对耐药性毛样细胞白血病及其他恶性肿瘤产生了完全的缓解作用。但免疫细胞抗体表位的鉴别也是极为困难的事情［12］。最近发展的T细胞表位定位工具有助于鉴别、修饰与免疫原性相关的T细胞表位，为去除抗体表位提供了新的希望［13］。然而，多次使用这种变异蛋白也可能产生针对新的表位的免疫反应。

2.4 PEG化 蛋白的PEG化可通过增加蛋白的溶解性和减少用药次数来减小免疫原性。PEG化可有效减小治疗酶如精氨酸酶、天冬酰胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶的免疫原性，因为PEG化阻碍了抗体的结合但并不妨碍小分子底物的扩散。但对于其他生物大分子而言，阻碍抗体的结合位点和保留受体结合位点往往不能兼顾。以重组人角质化细胞生长因子2(rhKGF－2)为例，rhKGF－2的N端PEG化后免疫原性显著减小，但是其有丝分裂促进活性也下降了约40%［14］。An QX等［15］也发现，PEG化后天花粉蛋白的免疫原性降低4倍左右，血浆中半衰期延长为原来的6倍，但也同样存在蛋白活性降低的问题。

2.5 鉴别和去除Ⅱ类MHC配位 通过鉴别和去除生物大分子的Ⅱ类MHC配位，可以避免与免疫原性相关的高亲和性IgG抗体的产生。相对于去除抗体表位而言，去除Ⅱ类MHC配位来降低免疫原性的方法更为可行，因为影响结合的因素更确定，结合位点的变化小得多，MHC分子及其结合专一性较为恒定。通过计算和实验的方法鉴别MHC配位后，可以采用诱发突变的方法产生不与MHC相互作用的变异序列，但通过实验的方法来选择免疫原性低的序列的效率较低，获得的较为理想的序列十分有限，而采用合理的蛋白设计方法如蛋白设计自动化(PDA)技术等可以发现稳定、活性好、免疫原性低的生物大分子［11］。

3 免疫原性的检测方法

鉴于治疗用生物大分子存在免疫原性的可能性，建立一种可行的方法来检测、定量和表征机体的免疫反应是相当必要的。现有的检测免疫原性的方法主要有:酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、表面等离子体共振法(SPR)、酶联免疫斑点法(ELISpot)、免疫PCR法(IPCR)、细胞增殖实验等，具体应用哪一种检测方法取决于生物大分子的类型及研究的目的［16］，而采用多种检测方法和多种受试对象有助于提高检测的准确性［17］。

3.1 ELISA 在检测免疫原性的各种方法中，ELISA因其能够高选择性、高灵敏度地检测特异性抗体而最为常用。在动物实验中，常以ELISA测定IgG、IgE的水平作为免疫原性强弱的指标［15］。临床试验中，Phillips等［18］采用 ELISA 法测定了病人服用干扰素β－1a(Avonex)后血中的IgG水平，证明不含人血白蛋白(HAS)的载药注射器剂型具有较低的免疫原性。

3.2 RIA RIA是利用放射性同位素标记的抗原和非标记抗原同时与数量有限的特异性抗体之间发生竞争性结合来测定免疫反应的方法。RIA技术极其敏感而又极其特异，可用于测定生物样品中抗体的含量［19］。但是RIA测定的指标是放射性同位素的放射强度，对仪器的要求比较高，而且要采取必要的防辐射措施，因此该法的实际应用不如ELISA普遍。

3.3 SPR SPR可以检测浓度极低或亲和力极小的抗体，是检测抗体的极为有利的手段。Nechansky［20］对ELISA和SPR进行了比较，认为对于直接ELISA，使用人抗的检测试剂不能用于人源化抗体的检测;对于双抗ELISA，必须精心优化试剂的浓度，检测试剂之间的反应复杂，检测过程费时费力等。而SPR技术无需二抗就能实时检测对某一配体的结合，灵敏度和选择性优于ELISA。除此之外SPR还可同时给出定性和定量的结果、可检测结合抗体的等型，并适用于亲和力小的抗体的检测。SPR操作简单、检测快速灵敏的优点在检测复杂生物样品中发挥着重要的作用［21，22］，但SPR昂贵的价格也极大地限制了其应用。

3.4 ELISpotELISpot的原理类似于ELISA，也是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白的方法，但它不仅能测定细胞因子生成量，还可通过计数检测分泌此细胞因子的细胞频率，灵敏度要高于ELISA，而且实验采用的捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子，因而近年相关的报道也不断增加［22，23］。

3.5 IPCR IPCR也是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增定量检测抗原使得IPCR的灵敏性高于ELISA。Spengler等［24］发现，与对应的ELISA比较，IPCR至少可使抗体检测的灵敏度提高1 000倍，而且本法中仅仅采用稀释的方法就可以消除生物样品中基质的干扰。

3.6 细胞增殖实验 与免疫相关的T细胞或B细胞增殖实验是免疫原性测定的又一方法。T细胞或B细胞的数量直接影响到它们释放的细胞因子的数量，进而影响机体的免疫反应，因此以生物大分子特异性免疫细胞的数量作为免疫原性测定指标的研究也多有报道［10］。

4 小结

随着治疗用生物大分子的广泛研究和应用，相关药物的免疫原性也日益受到关注。生物大分子的免疫原性受到患者、给药及药物相关的多种复杂因素的影响，虽然至今尚不能完全解释产生免疫原性的原因，但是一些减小免疫原性的切实可行的方法逐渐发展起来，如增加大分子的人源序列，去除抗体表位，PEG化等。同时，免疫原性的各种检测方法也应运而生，如 ELISA、RIA、SPR、ELISpot、IPCR、细胞增殖实验等技术使复杂生物样品中含量极低的抗体的检测得以实现。虽然人们在生物大分子的免疫原性弱化及检测方面尚处于探索阶段，但随着不断深入的理论认识及日新月异的生物技术的发展，必将会开发出强效、稳定以及免疫原性较弱的生物大分子药物，治疗用生物大分子药物将拥有更加广阔的应用前景。

［1］Jahn EM，Schneider CK.How to systematically evaluate immunogenicity of therapeutic proteins–regulatory considerations［J］.N Biotechnol，2009，25(5):280 －286.

［2］古宏标，杜勇，黄玮俊，等.我国汉族人群免疫球蛋白α1基因增强子区域hs1，2 VNTR多态性与高加索人种的比较［J］.中山大学学报(医学科学版)，2005，26(2):134－137.

［3］Schellekens H.Immunogenicity of therapeutic proteins:clinical implications and future prospects［J］.Clin Ther，2002，24(11):1720 －1740.

［4］Schellekens H.Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(6):457－462.

［5］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 1:Impact of product handling［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):310－317.

［6］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 2:Impact of container closures［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):318－324.

［7］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 3:Impact of manufacturing changes［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):325 －331.

［8］Karpusas M，Whitty A，Runkel L，et al.The structure of human interferon － beta:implications for activity［J］.Cell Mol Life Sci，1998，54(11):1203 － 1216.

［9］Gribben JG，Devereux S，Thomas NS，et al.Development of antibodies to unprotected glycosylation sites on recombinant human GM － CSF［J］.Lancet，1990，335(8687):434－437.

［10］Ilchmann A，Burgdorf S，Scheurer S，et al.Glycation of a food allergen by the Maillard reaction enhances its T－cell immunogenicity:Role of macrophage scavenger receptor class A type I and II［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，125(1):175 －183.

［11］Chirino AJ，Ary ML，Marshall SA.Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics［J］.Drug Discov Today，2004，9(2):82 －90.

［12］Nagata S，Pastan I.Removal of B cell epitopes as a practical approach for reducing the immunogenicity of foreign protein － based therapeutics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(11):977 －985.

［13］Weber CA，Mehta PJ，Ardito M，et al.T cell epitope:Friend or Foe?Immunogenicity of biologics in context［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(11):965 －976.

［14］Huang ZF，Ni CY，Chu YH，et al.Chemical modification of recombinant human keratinocyte growth factor 2 with polyethylene glycol improves biostability and reduces animal immunogenicity［J］.J Biotechnol，2009，142(3 －4):242 －249.

［15］An QX，Lei YF，Jia N，et al.Effect of site － directed PEGylation of trichosanthin on its biological activity，immunogenicity，and pharmacokinetics［J］.Biomol Eng，2007，24(6):643－649.

［16］Shankar G，Pendley C，Stein KE.A risk－based bioanalytical strategy for the assessment of antibody immune responses against biological drugs［J］.Nat Biotechnol，2007，25(5):555 －561.

［17］Dobrovolskaia MA，Germolec DR，Weaver JL.Evaluation of nanoparticle immunotoxicity［J］.Nat Nanotechnol，2009，4(7):411 －414.

［18］Phillips JT，Rice G，Frohman E，et al.A Multicenter，Open－ Label，Phase II Study of the Immunogenicity and Safety of a New Prefilled Syringe(Liquid)Formulation of Avonex in Patients with Multiple Sclerosis［J］.Clin Ther，2004，26(4):511－521.

［19］Svenson M，Geborek P，Saxne T，et al.Monitoring patients treated with anti－TNF－α biopharmaceuticals:assessing serum infliximab and anti － infliximab antibodies［J］.Rheumatology(Oxford)，2007，46(12):1828 －834.

［20］Nechansky A.HAHA – nothing to laugh about.Measuring the immunogenicity(human anti－human antibody response)induced by humanized monoclonal antibodies applying ELISA and SPR technology［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51(1):252 －254.

［21］Sickert D，Kroeger K，Zickler C，et al.Improvement of drug tolerance in immunogenicity testing by acid treatment on Biacore［J］.J Immunol Methods，2008，334(1 － 2):29－36.

［22］Koren E，De Groot AS，Jawa V，et al.Clinical validation of the“in silico”prediction of immunogenicity of a human recombinant therapeutic protein［J］.Clin Immunol.2007，124(1):26－32.

［23］王若峥，谭遥，王多明，等.酶联免疫斑点法检测鼻咽癌患者放疗前后T细胞对EB病毒肽段的特异性反应［J］.肿瘤防治研究，2009，36(11):928 －931.

［24］Spengler M，Adler M，Jonas A，et al.Immuno－ PCR assays for immunogenicity testing［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，387(2):278 －282.