奶水牛血清和卵泡液中瘦素水平的相关性研究

杜玉兰，毕芳芳，何宝祥

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005；2.广西大学行健文理学院，广西南宁530005）

自从1994年Zhang Y等［1］在小鼠发现瘦素 （leptin）蛋白以来，引起了全世界研究者的广泛兴趣。leptin蛋白主要是由脂肪细胞合成和分泌的一种多肽类激素，leptin基因缺失小鼠会发生过度采食、过度肥胖和不育症。Campfield L A等［2］给leptin基因缺乏小鼠注射重组leptin，不仅可使该leptin基因缺失小鼠的食欲和体重减少 ，而且可使其生殖能力恢复。研究表明leptin受体分布于动物的多种组织，如下丘脑、垂体以及外周组织如心、肝、肺、生殖组织（卵巢、子宫、乳腺）、胃肠道等［3］，证明该激素与能量代谢［4］、繁殖［5］、发育编程等［6］、免疫［7］、炎症和疾病［8］的调节有关。Leon J S［9］指出，在leptin与繁殖的关系方面，人们普遍认为leptin通过下丘脑-垂体-卵巢轴发挥对繁殖的调节作用，但也有可能存在着它对卵巢的直接作用，有人证明leptin除了脂肪细胞合成外，也可以在卵母细胞、颗粒细胞及胎盘组织中合成，leptin能与卵泡颗粒细胞特异性结合。已有研究证明leptin与动物和人类的性甾体激素调节有关。在leptin的临床应用方面，已经有药用型leptin，即重组甲二磺酰人瘦素（recombinant methionyl human leptin）用于病人的治疗［10］，它是leptin基因的灭活突变体，也是目前唯一能用于病人的药用型leptin，试验证明它能改善leptin缺乏病人的代谢异常，能使因leptin变异所致肥胖者的体重显著减轻，患leptin缺乏的、脂肪营养不良综合征的病人可用该药物进行治疗。

在反刍动物和其他动物，血浆leptin水平与机体脂肪储量相关。有人认为通过它和IGF-1将营养状况信号传到大脑中枢，调节动物生殖功能。在人类已有研究检测血液和卵泡液中leptin水平的报道，但在水牛的资料非常少见。奶水牛是我国南方地区的主要大家畜品种之一，近年来对奶水牛的发展受到政府和农民的高度重视，奶水牛在农民增收和国民经济中占有重要地位，但水牛的营养与繁殖问题一直困扰着奶水牛业的发展，leptin关联着营养与繁殖。本研究试图通过检测奶水牛血清和卵泡液中leptin水平，探讨两者间是否存在相关性，为进一步研究奶水牛繁殖与营养之间的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器 leptin放射免疫试剂盒为北京北方生物研究所生产；测定仪器使用DFM-96型放射免疫计数仪，为合肥众成机电技术开发公司生产。

1.1.2 试验用动物及样品采集 被检奶水牛选自南宁市某屠宰场待屠宰的奶水牛44头，均为雌性，临床检查均健康，营养状况中等，年龄2岁～6岁，体重250kg～400kg。样品采集时保证每头牛都有血液和卵巢样品。血样在宰杀前采集，宰杀后收集卵巢，将卵巢带至实验室尽快分离卵泡液。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 在清晨奶水牛宰杀前，颈静脉采血，收集于事先准备好的干净试管内，带回广西大学临床兽医学实验室，室温放置分离血清，血清收集后及时置于-20℃冰箱，待被检样品全部准备就绪后，进行leptin测定。

1.2.2 卵泡液收集 在奶水牛宰杀后，立即无菌摘除卵巢，带回实验室，检查卵巢上卵泡的大小，对直径大于8mm以上的卵泡（确认为第3期卵泡），用1 mL注射器抽取卵泡液，要求抽出的卵泡液清亮、未发生血液污染。卵泡液盛于准备好的试管里，置于-20℃冰箱存放，待被检卵泡液样品采集完成后，与血清样品一起，同时分析leptin含量。

1.2.3 测定方法 采用放射免疫法测定，leptin试剂盒购于北京北方生物研究所，分析工作在广西医科大学内分泌实验室进行，按照试剂盒说明书进行测定。敏感度为0.2ng／mL，批内和批间误差分别为4.5%和6.7%。

1.2.4 统计分析 使用Excel软件，血清和卵泡液中的leptin含量检测结果用平均数±标准差。相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异显著。

2 结果

表1 奶水牛血清和卵泡液中leptin水平Table 1 The leptin levels of serum and follicular fluid in dairy buffalo

本试验共采集奶水牛血样44份，卵泡液样本34份（10头奶水牛无大卵泡），leptin水平检测结果见表1。经统计检验，血清leptin水平显著高于卵泡液的水平。对34头奶水牛的血清和卵泡液leptin水平的相关性分析结果见图1。相关性分析发现，相关系数达0.438，统计检验发现两者间的相关性达到极显著水平（P＜0.01）。

图1 奶水牛血清和卵泡液中leptin水平的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of leptin levels of serum and follicular fluid in dairy buffalo

3 讨论

3.1 血清leptin水平

本研究采用放免法检测了奶水牛血清中leptin水平，被检的44头奶水牛的平均水平为2.14ng／mL±0.75ng／mL。其中34头卵泡期水牛的为2.04 ng／mL±0.69ng／mL，10头黄体期水牛的为2.36 ng／mL±0.96ng／mL。我们研究小组曾对16头荷斯坦奶牛，均在分娩前后做了11次检测，发现血清leptin水平在2.99ng／mL±1.31ng／mL。关于水牛血清leptin水平的检测国内外报道很少，Campanile G等［11］在研究高、低两种不同能量的日粮对头胎摩拉水牛代谢和卵巢功能的影响时，报道了用放免法测定高能量组水牛血中leptin水平显著高于低能量组的水平（2.6ng／mL±0.2vs 1.8ng／mL±0.0ng／mL，P＜0.05），我们研究的被检牛血中leptin水平介于上述2组水平之间。李恭贺等［12］用ELISA方法检测发情前后水牛的血清leptin水平的动态变化，其测定范围在6ng／mL～18ng／mL之间，这是由于不同的检测方法所致。目前人们普遍认为，血清leptin可以抑制食欲、增加脂肪降解，抑制脂肪合成、增加能量开支。禁食可使其血浆水平下降，采食后可使其水平迅速升高。血清leptin水平主要反映动物体内脂肪储存情况。在能量代谢正平衡时期，肥胖动物的血浆leptin水平高，而消瘦者的低。本研究检测奶水牛的血清leptin水平，最低值0.94ng／mL，最高者为3.71 ng／mL，与被检水牛的临床营养状况一致。众所周知，奶水牛的营养体况与繁殖有一定关系，我们的研究发现，放牧饲养的不少水牛营养很差，很难受孕，因此推测，可能奶水牛消瘦，血液和卵泡液中的leptin水平较低，动物机体在营养与繁殖之间的调节机制中就确定不能受孕。营养不良不仅影响母畜繁殖性能，还会影响后代的繁殖能力，Tatiane D等［13］研究成年大鼠泌乳期间营养不良对其后代的卵泡产生、促性腺激素和leptin受体的表达影响，发现母鼠泌乳期间营养不良可使子鼠的卵泡（原始、初级、有腔）数量显著减少，使leptin和leptin受体和不同亚型的leptin受体（Ob-Rb）、芳香化酶和促性腺激素受体的mRNA表达量都显著减少。这些变化可能是母鼠围产期leptin水平改变的结果，说明leptin水平在出现长期营养代谢变化中对繁殖起着关键性的决定作用。今后应加强对母水牛包括泌乳期在内的各个生理阶段的营养研究，开展受孕和不孕动物间的leptin水平研究，以期进一步发现影响水牛繁殖率的营养机制。最新对奶牛的研究已经表明，乏情组奶牛血清中leptin浓度显著低于发情组，是导致奶牛乏情的直接原因［14］。

3.2 卵泡液leptin水平

国内外对奶水牛卵泡液leptin水平的报道尚未见到，我们对34头卵泡期水牛卵泡液的检测结果表明，leptin平均值为0.69ng／mL，显著低于血清水平。有报道［15］显示人类在采用超排技术与体外捡卵（OPU）时，其卵泡液与血清中leptin水平几乎一致（血清23.8ng／mL±20.9ng／mL，卵泡液23.7 ng／mL±20.5ng／mL），这是否由于在人使用了超排药物所致有待研究。水牛卵泡液leptin水平低，只有血清水平的32.2%，虽然供抽样的卵泡都是大卵泡（＞8mm），但最低值只有0.05ng／mL。Gastal M O等［16］报道，短期饲喂限制降低了母马血液和卵泡液中的leptin水平，在限饲48h达到显著水平，限饲48h血液leptin水平在4ng／mL～6ng／mL之间，卵泡液leptin水平为1.8ng／mL～3.0ng／mL之间，而未限饲的对照母马，血液和卵泡液中的leptin水平分别为9ng／mL～10ng／mL和4.5ng／mL～6.9ng／mL。

3.3 血清和卵泡液leptin水平相关性分析

本研究首次报道了水牛的leptin水平在血清和卵泡液之间存在着显著的相关性（r=0.438，n=34，P＜0.01），目前我们尚未看到水牛的相关报道。在对人类的研究中，有报道称，血中leptin水平在月经周期内波动，月经前比月经后高，妊娠时比绝经后的高。Birgül G等［15］发现，OPU当天的血清leptin水平与卵泡液的水平相似，并存在着极显著的相关性（r=0.996，P＜0.001）。OPU当天的血清leptin水平平均比基础水平升高66.4%，这种leptin水平的升高与卵泡期妇女的体重指数呈现强正相关（r=0.782，P＜0.01）。我们收集的是自然状态下的水牛卵泡液，未做超排处理，是否超排处理会引起奶水牛血清和卵泡液之间leptin水平差异变化，有待研究证实。Gastal M O等［16］虽然检测了母马血液和卵泡液中的leptin水平，但未分析血液和卵泡液leptin水平的相关性，报道了卵泡液leptin水平与被检母马的体况呈现显著正相关，由此可提示leptin在联系母马的营养与繁殖性能之间发挥作用。

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