液相色谱串联质谱测定动物肠衣中残留苯乙醇胺A

刘 谦，颜 红

（保定出入境检验检疫局，河北 保定 071051）

近年来，不断出现的“瘦肉精事件”涉及我国食品安全领域。2011年7月，某地从饲料中检测出了苯乙醇胺A，为新增的瘦肉精品种。苯乙醇胺与其他瘦肉精品种如莱克多巴胺等相比，同样可使生猪长速加快、皮红毛亮、瘦肉率高。人吃了含这种瘦肉精的猪肉后，可诱发高血压、心脏病等。

苯乙醇胺A又称为克伦巴胺，克仑巴胺，学名为2-4-（4-硝基苯基）丁基-2-羟基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一种人工合成的化学物质，被农业部第1519号公告列为禁止在饲料和动物饮水中使用的物质。

目前有关瘦肉精类残留检测的研究很多，相关的检测标准有农业部1025号公告，1063号公告，GB／T 21981-2008，GB／T 21313-2007等，研究对象有猪肉组织［1］，动物尿液［2］，猪肝脏和猪肌肉［3］，毛发［4］等，但是关于动物源性食品中苯乙醇胺A的研究很少。本文建立了动物肠衣中苯乙醇胺A残留的液相色谱-串联质谱检测方法，简便、快捷，灵敏度和准确度高，检测限达0.2μg／kg。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱-串联质谱联用仪（HPLC TQD），美国Waters公司。MCX固相萃取柱，60mg／3mL，美国 Waters公司。甲醇、乙腈、甲酸、正己烷为色谱纯。氨水为分析纯。实验室用水均使用娃哈哈纯净水。

2.0 mol／L乙酸铵缓冲溶液（pH 值＝5.2）：称取77.0g乙酸铵溶解于450mL水中，用乙酸调节pH值＝5.2后，定容至500mL。氨水-乙腈（5＋95）：准确量取5 mL氨水用乙腈定容至100mL。0.1%甲酸／水。β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶（β-Glucuronidase／aryl sulfatase）。

1.2 标准溶液的配制 （1）标准溶液贮备液（400 ng／mL），北京市兽医药品监察所赠，-20℃保存。

（2）标准工作溶液的配制：移取储备液适量，用甲醇稀释成20ng／mL。密封，4℃冷藏。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Xbridge C18柱，5μm，2.1mm×150mm；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，流速0.3mL／min，梯度洗脱；进样体积10μL；柱温35℃。

1.3.2 质谱条件 离子源ESI（电喷雾离子源）；扫描方式正离子扫描；检测方式MRM（多反应监测）；离子源温度120℃；雾化气温度350℃；毛细管电压3.2kV；锥孔电压20V。

1.3.3 样品前处理

1.3.3.1 酶解 准确称取2g（精确到0.01g）猪肠衣／羊肠衣样品于50mL具塞离心管内，加入20.0 mL乙酸铵缓冲溶液（pH值＝5.2），β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶40μL均质混匀1min，涡旋提取5 min，超声提取2min，37℃下避光水浴振荡16h。

1.3.3.2 净化 酶解液冷却后以大于等于8000 r／min离心10min，将上清液过滤至50mL具塞离心管内，加入15mL正己烷，用力振摇2min后以大于等于8000r／min离心10min，吸去正己烷层。下层清液做备用液。

MCX固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL活化，取备用液全部过柱，过滤液速度小于等于2mL／min，接着依次用水、甲醇各3mL淋洗，5mL氨水-乙腈洗脱并且收集。洗脱液在45℃氮气吹干。用1 mL的0.1%甲酸／水溶解残渣，加1mL正己烷用力振摇，下层液体过0.22μm膜过滤，上机测定。

2 结果

标准品和加标样品特征离子谱图在上述仪器条件下，保留时间为9.51min，测试结果见图1～3。图1表示的是苯乙醇胺A标准品出峰图，图2表示的是苯乙醇胺A标准品提取离子出峰图，图3表示的是苯乙醇胺A添加1.25μg／kg出峰图。可以看到，在相应的保留时间内，空白组织对测试物没有任何干扰，苯乙醇胺A峰形尖锐而对称。

2.1 标准曲线的绘制 取空白阴性肠衣样品，移取一定量标准工作液进行添加，使其浓度为0.5、1.5、2.5、4.0ng／mL。经样品处理过程后上机检测，以苯乙醇胺A特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其相应的回归方程和相关系数如下，线性方程为y＝142.699x＋0.49，相关系数r＝0.999。

2.2 回收率和精密度测定 称取空白肠衣2.0g（准确至0.01g），置于50 mL具塞离心管中，设0.25μg／kg、0.75μg／kg、1.25μg／kg 3个添加水平，每个浓度做8个平行，按2.3.3项下方法处理，取10μL进样分析，每个浓度重复进样3次。根据峰面积计算添加回收率和变异系数（CV）。添加回收率和变异系数见表1。

表1 肠衣中苯乙醇胺A添加回收结果

2.3 灵敏度的测定 按照信噪比S／N＝3确定为检测限（LOD），S／N＝10（LOQ）确定为定量限［5］。定量限：取空白猪肌肉组织添加浓度为0.25μg／kg，按照1.3.3项下方法处理后测定，信噪比S／N＞10（按噪音基线放大计），表明方法的定量限可至0.25μg／kg。检测限：取空白猪肌肉组织添加浓度为0.2μg／kg，按照1.3.3项下方法处理后测定，信噪比S／N＞3（按噪音基线放大计），表明方法的检测限可至0.2 μg／kg。

图3 苯乙醇胺A添加1.25μg／kg的提取离子流图

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 苯酚型苯乙胺类药物的代谢过程比较强［6］，蛋白结合率较高，需要酶解。而苯胺型的克伦特罗的蛋白结合率低不需要酶解。苯乙醇胺A从结构上看没有羟基和氨基直接和苯环相连见图4，但是为了尽量提高其提取效果，将少量与蛋白结合的苯乙醇胺A游离出来，因此也采用了乙酸铵提取，β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶酶解的过程。

图4 苯乙醇胺A结构式

3.2 肠衣样品的处理 肠衣是动物内脏中最长的小肠，不同的动物个体基质不同，有的猪肠衣带脂肪多，有的羊肠衣杂质含量大，因此选用合适的组织处理方法很重要。冷却后的酶解液用正己烷萃取，去除样品中的大部分油脂；储备液净化过柱后，再次用正己烷萃取，得到的谱图背景噪音低，谱图干净，效果比较理想。

3.3 基质效应的影响 基质效应在检测过程中是影响很严重的，用流动相来配制标准曲线进行定量，与基质校准曲线差异比较大。取2个空白肠衣样品，分别添加11ng和13ng，经酶解净化后上机检测，结果如下。

表2 流动相配制曲线定量结果和基质校准曲线定量结果

从检测结果可以看出，对同一个样品来说，基质曲线校准后，检测值高于流动相曲线定量结果，这是由基质效应引起的。ESI源离子化过程在液相中发生，存在基质成分和目标组分竞争电离的现象。因此在实际检测中，一定要用基质曲线校准。

4 结语

用乙酸铵提取，β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶酶解，针对不同的肠衣样品，利用正己烷萃取，样品经MCX固相萃取柱净化处理，液相串联质谱进行检测，回收率和精密度均比较理想。

［1］夏双梅.高效液相色谱／质谱联用检测猪肉组织中盐酸克仑特罗［J］.肉类工业，2006，9：25-27.

［2］罗燕，李俊演，谭磊.动物尿液中莱克多巴胺的检测方法分析［J］.国外畜牧学-猪与禽，2010，30（4）：64-65.

［3］黄士新，周光宏.β-激动剂克伦特罗在猪肝脏和肌肉组织中的残留［J］.中国畜牧杂志，1999，35（1）：3-4.

［4］吴泽君，龙凌云，郭世明.高效液相色谱-串联质谱法研究猪毛发中克仑特罗和莱克多巴胺的残留及代谢规律［J］.中国兽药杂志，2010，44（8）：22-26.

［5］李明洲，陈磊，柏凡，等.盐酸克伦特罗在雅南猪和长雅猪肝脏中残留的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2007，2：67-68.

［6］孙志文，闫小峰.猪肌肉组织中苯乙醇胺A残留液相色谱-串联质谱检测方法［J］.中国兽医杂志，2011，47（4）：72-73.