抗IBDV－IBV二联卵黄抗体的制备与应用

曾祥伟，徐亚萍，李志军，李梦溪

（东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

鸡传染性囊病是由传染性囊病病毒（IBDV）引起的幼鸡的一种急性、高度接触性传染病。传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引发的鸡的一种急性、高接触性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。这两种病毒性疾病一直是危害世界养禽业的重要传染病，主要依靠接种疫苗进行防控。然而，随着这两种病毒的不断变异，疫苗接种也不能达到理想的保护效果。近两年来，黑龙江地区的一些养殖场多次发生了IBDV和IBV混合感染，导致大批幼龄鸡只发病死亡，造成巨大的经济损失。鉴于此，本试验将从当地分离的这两种疫病流行毒株制作成油佐剂灭活疫苗，对刚开产的蛋鸡进行多次加强免疫，制备抗IBDV－IBV二联高免卵黄抗体，尝试对当地发生的疫情进行有效控制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 30只20周龄健康的海赛克斯蛋鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验牧场提供，它们均经过了IBD、IB的常规基础免疫。

1.2 主要试剂 IBD琼扩标准抗原、IBD琼扩标准阳性血清，鸡传染性支气管炎凝集抗原与标准阳性血清，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。Span白油、甲醛、氯仿等，购自哈尔滨联星生物公司。

1.3 IBD、IB油佐剂灭活疫苗 现场采集的已确诊为IBD的典型病鸡的新鲜腔上囊，与生理盐水按1∶5比例匀浆，反复冻融3次，3000r／min离心30 min，取上清用甲醛灭活，并配以油佐剂制成灭活苗。将从当地养殖场分离的IBV接种10日龄鸡胚尿囊腔，37℃培养36～40h，收集尿囊液，经甲醛灭活后加油佐剂，制成油乳剂灭活苗。

1.4 免疫方法 用制备好的IBD油乳剂灭活苗和IB油乳剂灭活疫苗对试验鸡进行分别肌肉注射，每种疫苗的接种剂量为2mL／只，每间隔10d，以油乳剂灭活苗分别做3次加强免疫，剂量同上。此后定期检测卵黄抗体的水平，待抗IBDV琼扩效价达1∶128以上，抗IBV的Hl效价达1∶1024以上时开始收集高免蛋，4℃储存备用。琼扩效价降低到1∶64，Hl效价降低到1∶512时停止收蛋，再进行加强免疫。

1.5 卵黄抗体的制备 收集的高免蛋先用自来水将蛋表面冲洗干净，再放入0.5%新洁尔灭溶液中浸泡消毒，然后取出用酒精棉擦拭蛋壳，打开蛋壳，无菌分离蛋黄，加入灭菌生理盐水做适量稀释。再以氯仿为溶剂与卵黄生理盐水等量混合，室温下放置6h以上，期间振荡2～4次，使其充分溶解。2000r／min离心20min，收集上清。最后按每mL加入青霉素1000IU、链霉素1000μg，并按总量的0.01%加入硫柳汞防腐，经双层灭菌纱布过滤，即为制备的卵黄抗体。

1.6 无菌检验和安全检验 取高免卵黄抗体0.2 mL，分别接种于鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌气肉肝汤培养基，37℃培养48h，观察有无细菌生长。用14日龄健康雏鸡10只，各皮下注射本品10mL。观察10d，记录雏鸡的健康和存活情况。

1.7 效价测定 取待检卵黄抗体液，以琼脂扩散法（AGP）检测抗IBDV抗体效价；以血凝和血凝抑制试验（HA－HI）检测抗IBV抗体效价。

1.8 临床应用试验 哈尔滨市郊的某养禽场发生了疫情，死亡幼鸡100多只，经临床剖检和实验室诊断，结果为IBDV、IBV混合感染。选取出现发病症状的鸡120只，随机分成两组。一组用制备的抗IBDV－IBV二联卵黄抗体以肌肉注射进行治疗，每天2次，连续治疗1周；另一组按照以往的治疗方法进行处理，病毒唑加抗生素肌肉注射，每天2次，连续治疗1周。对没有出现症状的鸡同时注射该二联卵黄抗体进行预防，每天1次，连续用3d。观察并记录鸡只的健康状况和存活情况。

2 结果

2.1 无菌检验和安全检验 制备的卵黄抗体接种3种培养基均无细菌生长；接种的10只雏鸡健康状况良好，未见任何不良反应。

2.2 卵黄抗体效价测定 经AGP法检测抗IBDV抗体效价为1∶256，HA－HI法检测抗IBV抗体效价为1∶1024，满足生产中对抗体效价的要求。

2.3 临床应用观察 对于发病鸡，应用卵黄抗体的效果要明显高于常规病毒唑加抗生素的治疗效果，具体结果见表1。没有出现症状的鸡注射卵黄抗体后，没有1只出现感染症状，均十分健康，预防有效率达100%。

表1 卵黄抗体治疗效果的测定

3 讨论

卵黄抗体产量高，不受地域和时间的限制；生产成本较低，收集和提纯方便，大规模提取抗体的技术已经成熟；因此被广泛用于动物传染病的紧急治疗和预防中［1－2］。不论鸡IBD的卵黄抗体还是IB的卵黄抗体的制备和应用都常有报道，而将两者结合制备二联抗体却鲜有报道。本研究制备了抗IBDVIBV二联卵黄抗体，主要是针对当地一些养殖场多次发生了IBDV和IBV混合感染的疫情而定的。从当地分离的病毒株制成灭活疫苗用于加强免疫，这样获得的高免卵黄抗体针对性更强，因此在当地疫情的预防和治疗上取得了良好的效果。但是如果在其他地区应用，其预防和治疗的有效性还有待验证。

在临床试验中，注意到卵黄抗体治疗组中死亡的7只鸡主要是处在发病的晚期或者有继发感染，而处于发病早期的病鸡全部恢复。这也验证了一些学者的研究［3］，即证明卵黄抗体在发病的早期应用通常会收到良好效果，给疾病的中晚期应用效果则不明显。因此，在实践中，一定要注意卵黄抗体应用的时机，越早注射越能快速控制疫情发展。

［1］ 李文学，青学刚，刘刚.高免卵黄抗体应用研究现状及发展趋势［J］.安徽农业科学，2010，38（24）：12981－12982.

［2］ 崔桂清，李火举.卵黄抗体在防治仔猪腹泻上的应用［J］.中国兽医杂志，2010，46（3）：61－63.

［3］ 张铁，王春光.抗鸡新城疫和传染性法氏囊病高免卵黄抗体的正确应用［J］.四川畜牧兽医，2002，29（2）：46.