雷公藤多苷对佐剂性关节炎大鼠P物质表达的影响

戴巧定 宋欣伟 浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006康海英 杭州市余杭区第五人民医院

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性多关节肿痛为主要临床表现，严重影响患者生活质量的自身免疫性疾病。确切病因及发病机制迄今不明，其基本病理特征为滑膜炎，细胞因子在滑膜病变中起核心作用，其中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-a，TNF-α）和白介素（interleukin-1β，IL-1β）均是RA发病机制中居中心地位的促炎细胞因子[1]。有研究显示[2-5]，RA患者在神经免疫调节方面有诸多异常改变，与多种神经肽有关，其中P物质（substance P，SP）是一种神经递质，在炎症、疼痛的发生机制中都占有重要的地位，对关节炎的发生发展有重要促进作用。雷公藤（Tripterygium wilfordii．Hook）治疗RA疗效肯定，具有缓解症状和改善病情的双重作用[6]。本研究应用佐剂性关节炎大鼠模型，予雷公藤多苷灌胃治疗，观察大鼠血液、关节滑膜等外周组织以及中枢脊髓后角的SP水平的变化，初步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康Wistar雄性大鼠，体重150±10g，清洁级，由浙江中医药大学实验动物中心提供。1.2 试剂与仪器 不完全弗氏佐剂：Sigma公司；冻干注射用灭毒卡介苗（BCG）：上海生物制品研究所；P物质放免试剂盒：北京华英生物技术研究所；TNF-α、IL-1β放免试剂盒：北京北方生物技术研究所；SN－695型智能放免r测量仪：上海原子核研究所日环仪器一厂；GC-911-r-放射免疫技术仪：中国科技大学实业总公司；雷公藤多苷片，上海医科大学红旗制药厂，批号060603，规格10mg/片，临用前用蒸馏水配成0.5mg/mL混悬液。

2 实验方法

2.1 模型建立 造模组大鼠右侧后肢足跖部皮内注射0.1 mL完全弗氏佐剂，正常组注射0.1mL生理盐水。致炎前，用电子天平测量大鼠体质量，用足趾容积测量仪测量每只大鼠右后足(标记线以下)的足容积（mL3），作为模型前的足基础容积，代表造模前情况。致炎后15天，再次称重、测量大鼠两侧脚掌的体积，并根据成功评判指标[7]判断造模是否成功，并剔除造模不成功者。

2.2 分组及给药 实验大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤组，各10只。造模成功（致炎后15天）后开始给药，雷公藤组给予雷公藤多苷片，每鼠每次给药2 mL，每天灌胃2次；正常及模型组每鼠每次给蒸馏水2 mL，每天灌胃2次，共30天。

2.3 观察指标与标本采集 致炎前用足趾容积测量仪首先测量并记录各组大鼠右后足的足容积（mL3），致炎后密切观察足跖肿胀情况，并分别于致炎后1、15、30、45天测量各组大鼠体质量及右后足的足容积（mL3），同时观察治疗药物对大鼠足跖肿胀的影响。给药30天后取各组大鼠的静脉血，离心后提取血浆，剩余全血离心后提取血清，均置于－20℃保存备用；同时迅速取出AA大鼠脊髓腰段及L3～5对后根神经节，经液氮冻存后，用打孔法取出脊髓后角，经4℃低温离心机4 000 r/min离心10 min后，提取上清液并－70℃密封保存，备测；制备大鼠膝关节滑膜并提取上清液，－70℃保存备检。

2.4 标本放射免疫法测定 严格按照试剂盒说明操作，将制备好的血浆、血清、脊髓上清液、滑膜上清液分别进行P物质、TNF-α、IL-1β测定。

3 实验结果

3.1 各组大鼠右足跖肿胀程度 致炎后第1、15天，模型组大鼠右足跖与正常组比较肿胀明显（P＜0.05）；雷公藤组予灌胃治疗30天后，与模型组比较，右足跖肿胀明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠右足跖肿胀程度比较（±s）mL3

表1 各组大鼠右足跖肿胀程度比较（±s）mL3

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

15天1.12±0.02 1.87±0.06*1.91±0.13*组 别正常组模型组雷公藤多苷组n/只10 10 10 0天1天1.05±0.05 1.05±0.06 1.04±0.06 1.06±0.08 2.07±0.12*2.04±0.17*30天1.20±0.15 1.80±0.07*1.70±0.11*△45天1.30±0.02 1.68±0.07*1.50±0.08*△

3.2 各组大鼠体质量变化 致炎后大鼠体质量较正常大鼠增长明显缓慢，予雷公藤多苷干预后，体质量增加较模型组快，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠体质量比较（±s）g

表2 各组大鼠体质量比较（±s）g

注：与正常组比较，*P＜0.05

15天200.00±9.32 174.40±6.80*170.00±6.20*组 别正常组模型组雷公藤多苷组n/只10 10 10 1天162.12±2.78 159.31±1.03 151.20±3.62 30天266.25±7.54 190.40±9.55*196.80±7.56*45天302.00±8.04 209.20±5.11*221.80±7.56*

3.3 各组大鼠SP水平比较 造模成功后，模型组大鼠脊髓后角、血浆和滑膜中的SP水平均明显高于正常组（P＜0.05）；药物干预后，与模型组比较，雷公藤组大鼠血浆、滑膜SP水平降低（P＜0.05），其中滑膜SP水平接近正常组水平（P＞0.05），但脊髓后角SP水平在治疗30天后无明显下降（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠血浆组织SP含量比较（±s）pg/mL

表3 各组大鼠血浆组织SP含量比较（±s）pg/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别正常组模型组雷公藤多苷组n/只10 10 10脊髓后角15.76±6.76 24.76±2.87*24.17±11.23*血浆26.45±11.26 65.58±24.45*43.48±14.78*△滑膜134.72±13.32 209.86±13.75*132.86±43.49△

3.4 各组大鼠TNF-α、IL-1β水平比较 与正常组比较，造模成功后，模型组大鼠血清、滑膜中的TNF-α、IL-1β 水平显著升高（P＜0.05）；给药后，与模型组比较，雷公藤组大鼠血清、滑膜中TNF-α水平及滑膜中 IL-1β 都显著降低（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠血清组织TNF-α、IL-1β水平比较（±s）pg/mL

表4 各组大鼠血清组织TNF-α、IL-1β水平比较（±s）pg/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

TNF-α血清 滑膜0.53±0.21 0.66±3.63*0.68±3.87*组 别正常组模型组雷公藤多苷组n/只10 10 10 7.80±5.16 9.98±1.38*7.93±4.54△49.27±5.98 177.71±86.06*120.50±43.56*△IL-1β血清 滑膜30.60±16.90 54.71±18.57*31.08±7.80△

4 讨论

目前认为，多基因和环境因素共同诱发RA病理性自身免疫反应，并导致RA表现以破坏性多关节炎和不同的关节外炎症病变，其中细胞因子在其病变中具有重要作用，TNF-α、IL-1β均是RA发病机制中居中心地位的促炎症细胞因子。在RA患者血液及炎性滑液中均可检测出高浓度的TNF-α和IL-1β，并与关节炎活动程度相一致，应用TNF-α单克隆抗体以及IL-1受体拮抗剂可以明显改善RA患者的病情[8]。

SP是最早发现的一种神经肽，属于哺乳动物速激肽家族，在哺乳动物体内广泛存在，具有重要的免疫调节功能。SP对伤害性感受器及炎症有初级的始动作用，即周围神经末梢由于组织损伤或炎症时释放的化学介质变得敏感，释放SP。SP作用于T、B淋巴细胞膜上的SP受体，能增强T细胞增殖功能，调节B细胞合成免疫球蛋白，促进肥大细胞脱颗粒，释放组胺及5-羟色胺，促进各种细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的产生，进一步加重炎症。SP也是一种舒血管物质，能增强血管通透性，导致血浆渗出和水肿，因此在关节炎的病理状态下，关节局部SP浓度上升可导致毛细血管扩张，通透性增加，出现红肿的临床表现[9]。Lotz等[10-11]等对类风湿关节炎患者的滑膜组织进行体外培养，显示SP能使类风湿关节滑膜组织增生，刺激胶原酶、前列腺素E2释放，后两者又增加了RA滑膜细胞增殖，且这种作用可被SP拮抗剂抑制，提示神经末梢释放的SP可以直接参与类风湿关节炎的病理过程。这表明SP在关节炎的血管翳形成、软骨与骨破坏中起重要作用。并有最新研究显示[3]，依那西普（TNF-α抑制剂）治疗RA患者11例，血清中SP水平明显下降。

SP既是炎症介质，同时又是一种疼痛递质，处于致痛机制中的中心地位，在脊髓背角胶质区富含SP传入纤维末梢，持续电、热、化学等外周伤害性刺激可引起传入纤维末梢SP释放，脊髓背角的SP明显增多。傅开元等[12]发现疼痛性颞下颌关节紊乱综合征（TMJDS）患者关节液SP含量明显高于无痛性TMJDS。SP能传导及易化初级伤害性刺激，还能促进另一种疼痛介质前列腺素E2的分泌，激活依靠前列腺素的感受伤害途径，这可能是关节疼痛传递的机制之一。SP还可刺激肥大细胞脱颗粒，释放组织胺等非神经源性疼痛介质而致痛。另外，SP诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子具有明显的诱导痛觉过敏的作用。SP的这些作用均促进疼痛的产生，加重疼痛反应[13]。

雷公藤为卫茅科植物，研究表明，雷公藤具有抗炎、免疫抑制及抗增殖等作用，广泛应用于类风湿性关节炎（RA）、肾小球肾炎、皮肤病、肿瘤等多种疾病的治疗，疗效肯定。雷公藤治疗RA的细胞与分子生物学主要机制：通过抑制细胞内转录因子活性减少炎症部位炎症介质、细胞因子、趋化因子、黏附分子等水平，减少炎症反应；通过诱导T淋巴细胞和滑膜细胞发生细胞凋亡，产生免疫抑制和抑制血管翳增殖作用，达到控制RA活动进展的目的[6]。临床发现，雷公藤多苷既具有抗炎免疫抑制作用，又有镇痛作用。李振军等[14]认为，中枢SP与免疫功能有关，提示雷公藤多苷对佐剂性关节炎的治疗可能是通过提高中枢SP含量抑制免疫。本研究结果显示，SP在AA大鼠的外周及中枢组织中高表达，与TNF-α、IL-1β的水平相一致，提示SP在RA的炎症及疼痛过程中起重要作用，与以往研究结果一致。雷公藤多苷治疗后，关节肿胀改善，其作用途径可能通过抑制血液及滑膜中的SP、TNF-α和IL-1β水平而起到抗炎免疫抑制及镇痛作用，且对滑膜的影响大于血液，但对中枢SP水平无影响，可能与用药剂量、作用时间或样本量等多种因素有关。同时SP作为疼痛介质，中枢SP是否与疼痛关系更为密切，非甾体消炎药的治疗能否降低其水平，尚有待于进一步研究。

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