食蟹猴左足三里穴针刺fMRI研究

武鹏飞 孙向东 任庆国 李传福 徐 惠

(1．泰山医学院，山东泰安 271016;2．泰安市计量测试所，山东 泰安 271000;3．山东大学齐鲁医院，山东 济南 250012)

针刺(acupuncture)又称针灸，是中国的传统医 学，其疗效得到普遍肯定，但是其原理却一直无法以现代医学彻底阐明。足三里穴是足阳明胃经的合穴，是补益要穴，是最常用的治疗穴位之一。多年来的研究结果表明，针刺穴位与神经系统的活动有密切联系，特别是与大脑特定皮层功能有关。功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)是建立在血氧水平依赖(BOLD)的基础上的MRI技术，通过检测特定刺激引起的局部T2加权像信号的变化揭示特定刺激或任务与相应脑组织的解剖与生理关系。fMRI的应用为针刺机制的探讨提供了有利的手段。

非人灵长类动物在结构和生理功能等方面与人类相似，其生理、病理的研究结果对认识人类生理、病理的发生机理等医学研究有重要的参考意义。食蟹猴是较为常用的非人灵长类实验动物。通过针刺食蟹猴左三里穴fMRI的研究，可以探讨足三里穴针刺刺激引起的非人灵长类动物脑功能活动，并为病理状态下的fMRI研究提供对照。

1 材料与方法

1．1 研究对象

食蟹猴(macaca fascicularis)，属于灵长目(order Primates)猴科(family Cercopithecidae)，猕猴属(genus Macaca)，又名长尾猕猴、爪哇猴。采用食蟹猴6只，均为雄性，4 ～5 岁，体质量 4．75 ～5．30 kg，平均4．94 kg。六只猴均营养状态良好，精神状态正常，无神经系统病史，近期无药物使用史。

1．2 实验设备

采用GE Signa Excite 3．0T MR扫描仪(Milwaukee，Wisconsin，USA)，梯度场40 mT/m ，梯度切换率150 mT/m/ms。食蟹猴颅脑扫描使用正交膝关节线圈，启用呼吸监控。

1．3 食蟹猴麻醉

MR检查前4 h禁食、水。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛联合麻醉。5%氯胺酮诱导麻醉，剂量5 mg/kg，下肢肌肉注射，10%水合氯醛灌肠维持麻醉，剂量1 ml/kg。

1．4 针刺fMRI实验设计

对每只食蟹猴针刺左侧足三里穴(zusanli，ST36)的同时进行功能成像扫描。扫描时，采用相同的周围环境，食蟹猴头周耳旁充填软垫阻隔声音，仅留微弱灯光供施针医师针刺时使用。对于每只实验猴，针刺刺激采用"OFF－ON－OFF"组块设计(图1)，即"静息－刺激－静息"设计模式。功能成像BOLD序列共采集128phase，其中第1～8phase为静息状态不予实验气体气味刺激;之后以每10phase为一个组块，分别予以"刺激 －静息 －刺激 －静息"，共12个组块，采集120phase。每phase采集8层图像，每次fMRI实验共采集1024幅图像。针刺任务过程包括:刺入－捻转－拔出。静息状态时银针不留置体内。

图1 fMRI"OFF－ON－OFF"组块设计

1．5 针刺取穴

选择左侧足三里穴。针刺过程由同一名有10年针刺经验的针灸医师完成。取穴时按照针灸动物实验的常规，根据猴与人体型大小比例，在食蟹猴体表选取相同部位。银针选用0．35mm×40mm标准银针。食蟹猴麻醉前备皮，用75%医用酒精消毒，在清醒状态下进行预实验针刺，观察动物在针刺穴位捻转时出现与针刺非穴位处不同的抽动、不适的表现，认为得气，穴位准确，确定针刺位置并用龙胆紫标记定位，正式实验时采用相同的穴位位置。针刺手法采用"平补平泻"法，捻转均匀，提插幅度适中。

1．6 fMRI扫描参数

食蟹猴麻醉后仰卧于检查床上，头置于正交膝关节线圈内正中，听眦线垂直于床面，头周围用软垫充填以减少磁敏感伪影。

MRI扫描序列包括液体衰减反转回复(fluidattenuated inversion recovery，FLAIR)T1WI序列、fMRI－BOLD扫描。FOV均为14 mm。首先使用轴位FLAIR T1WI序列进行解剖像扫描，扫描线平行于前后连合连线(AC－PC线)，扫描范围自顶部皮肤至延髓下端，包括全部脑组织。FLAIR T1WI序列参数:TR 2400 ms，TE 9．4 ms，TI 860 ms，ETL 8，Bandwidth:31．25，矩阵320 ×224，NEX 1。扫描层厚2．1 mm，层间隔 0．2 mm。FLAIR T1WI扫描图像作为fMRI扫描的定位像。fMRI－BOLD扫描采用梯度回波－回波平面成像(gradient echo－echo planar imaging，GRE －EPI)序列，TR 3000 ms，TE 60 ms，FA:90°，矩阵64 ×64，NEX 1，采用压脂技术，间隔采集。鉴于该设备限定每次fMRI扫描总层数不得超过1024层，为得到更多的图像数据，将整个猴脑分为上下两部分分两次扫描，每次扫描8层，两次扫描通过复制定位像和定位线的方法使扫描层面相延续。第二次扫描紧接第一次扫描进行，以免时间延迟导致实验猴体位变化。fMRI扫描序列的扫描方位、位置、层厚、层间距、层数、视野等参数与FLAIR T1WI扫描序列完全一致。每次实验扫描一半颅脑，8层，128 phase，扫描时间 6min24s，得到 1024 幅图像，整个猴脑共扫描16层，得到2048幅图像。

1．7 fMRI数据处理

采用运行于Matlab(7．0．1)平台的专业医学图像处理软件－统计参数图2(statistical parametric mapping 2，SPM2)处理实验数据。猴脑fMRI SPM2处理包括以下10个过程:删除前8 phase静息态采集图像、转换图像格式、头动校正、去头皮、图像标准化、fMRI设计、数据调入、评估、计算结果、解剖图像覆盖等过程。

删除前8 phase静息态采集图像:实验之初，食蟹猴尚未达到稳定状态，因此丢弃前8 phase(64幅)静息态采集图像;将同一种实验的脑上下两部分图像按解剖层面、扫描顺序合并排序，使用ADCSee软件将图像批处理改名，每种功能状态的fMRI扫描共得到1920幅图像。

转换图像格式:MRI扫描获得的图像数据是DICOM格式，需要用MRICro软件将其转换成SPM可以分析的4D、3D的ANALYZE数据格式。

头动校正:在Matlab程序中载入SPM2软件，利用SPM2的realign功能进行头动校正，实现头部图像对齐。头动校正后观察校正曲线(图2)，平移(translation)＞1/2个体素或旋转(rotation)＞0．5°的图像认为体位移动过大，需要丢弃。本实验全部图像均为有效图像。

图2 SPM2 realign校正曲线

去头皮:因食蟹猴头皮组织厚、多，影响图像分析，手工切去食蟹猴功能图像的头皮组织。使用MRICro软件的ROI功能，沿脑实质边缘，逐层切去头皮及骨组织。以同样方式切去食蟹猴模板的头皮组织，使二者相匹配。

图像标准化:图像标准化是指利用统一的脑图像模板来标准化不同个体的脑，使得不同个体的脑组织功能活动情况统一到同一个脑坐标空间中，以进行统计计算，得到规律性的结果。食蟹猴脑模板采用 Black KJ等［1］(Washington University School of Medicine，St．Louis，MO)制作的食蟹猴模板。模板为食蟹猴颅脑轴位T1WI图像，体素大小为0．5 mm×0．5 mm ×0．5 mm，从顶部皮肤至延髓下方共89层横断面。标准化前，将程序默认的部分用于成人图像处理的参数根据食蟹猴的实际进行修改。使用SPM2程序的normalize功能进行图像标准化处理。

fMRI设计、数据调入、评估、计算结果、解剖图像覆盖:在SPM2中，为fMRI刺激设计建立模型，调入图像数据。

1．8 统计学处理

通过SPM软件，采用随机效应模式(random effect mode)进行组分析(group analysis)。采用单样本t检验(one sample t－test)来分析特定任务刺激下组激活的状态。设定检验水准α=0．05，激活区滤过的标准为＜10个体素。统计结果覆盖于食蟹猴模板图像上。

2 结果

针刺左侧足三里穴可以观察到在针刺刺激时，左侧中央前回、右侧中央后回、双侧岛叶、楔前叶、右侧颞叶激活(图3A)，信号增高，其中，激活最强点位于右侧颞上回(T=6．59)，坐标(14，－15，2);额叶、顶叶、枕叶、扣带回散在多数负激活点，在针刺刺激时信号减低(图3B)，其中，激活最强点位于右侧中央前回(T=9．2)，坐标(18，－5，10)。

图3 针刺左侧足三里穴猴脑正激活轴位断层功能定位像

图4 针刺左侧足三里穴猴脑负激活轴位断层功能定位像

3 讨论

3．1 BOLD －fMRI原理

BOLD－fMRI是依靠血红蛋白的磁性、根据MRI对组织磁化高度敏感的特点来研究人脑的功能，特别是大脑各功能区划分或定位的无创性检测技术。氧合血红蛋白为逆磁性，脱氧血红蛋白为顺磁性，氧合血红蛋白的磁敏感特性与一般组织相近，而脱氧血红蛋白的顺磁性会使局部血管内及血管周围出现非均匀性磁场，导致质子的失相位、T2*的缩短以及MR信号的损失。当脑组织中局部神经元活动时，局部组织内血流量及血氧消耗量均增加，但二者增加的比例不同，氧的供应量超过代谢的耗氧量，使局部静脉血氧浓度升高，脱氧血红蛋白含量降低，体素内失相位减少，T2*延长，在T2*加权像上信号强度增加。通过数学运算，将静息态的fMRI扫描数据与特定刺激状态下的fMRI扫描数据相比较，MRI信号有明显差异的脑组织区域即可推断为特定刺激所引起的脑功能变化的区域，即脑功能区。fMRI最常用于显示脑功能区活动时信号增加的激活，即正激活，但是也可以显示在功能区活动时信号反而减低的激活，即负激活。目前，负激活的原理尚不清晰，可能与功能区活动时耗氧量增加超过供氧量增加有关。

fMRI自20世纪90年代出现以来，在认知科学研究方面发挥了巨大的作用。人们利用fMRI做了很多中枢神经系统功能定位的研究，如:肢体运动、感觉刺激、情感刺激、学习记忆任务和药物反应实验，都观测到了特定中枢神经系统的活动，并得出了非常有意义的结论，为精确了解各种神经生理活动提供了有价值的参考。

3．2 针刺 fMRI

针灸的实践效果是广为人可的，然而其作用机理一直未完全揭开。经过神经生理学的研究，初步认为针灸刺激位于皮肤和肌肉内的小的有髓传入神经，将冲动传入中枢神经系统，产生一系列的神经内分泌机制，包括β2内啡肽等物质的释放，阻断痛觉传入大脑;另外，针刺作用于中脑两个下行系统:血清素源性控制系统、肾上腺素源性控制系统来控制痛觉。

多年来的研究结果表明，针灸穴位与神经系统的活动有密切联系，特别是与大脑特定皮层功能有关。应用fMRI可以直观地检测到针刺引起的中枢神经系统的活动［2－3］，为针灸作用机理的揭示奠定了一定的基础。1998年Cho ZH［4］等发表了第1篇有关针刺视觉相关穴位fMRI的研究论文，证实针刺与视觉相关的特定穴位可引起特异的脑部视觉中枢的激活。尹岭［5］等利用fMRI方法探讨针刺人足三里穴脑功能成像的实验方法和针灸治疗的机理。Wu MT［6］等利用fMRI验证了针刺合谷穴和人的大脑边缘系统的抑制相关，支持了针刺镇痛作用的机理。Lee JD［7］通过对比大脑中动脉闭塞所致偏瘫患者针灸治疗前后的fMRI研究，观测到针刺合谷、足三里、曲池等穴位对偏瘫患者的血供恢复有益。Kong J［8］、Li G［9］等利用 fMRI研究手针和电针对正常人脑的激活效应，发现电针和手针刺激有不同的脑组织区域被激活。多数研究［10－16］发现针刺不同的穴位时，第二躯体感觉区及岛叶常能观测到BOLD信号的增加。部分学者利用fMRI做动物实验，探讨针灸的作用机理。金香兰［17］等探讨了针刺大鼠的fMRI的动物实验方法，并且得到针刺大鼠足三里穴引起的部分脑区MRI信号增加，显示了fMRI在活体动物实验中研究针刺作用机理的可行性。

以人和大鼠等小动物为对象通过fMRI研究针刺作用的报道［18－20］已不少，然而，迄今尚无人采用高级非人灵长类动物进行针刺fMRI的研究，并借此与人类的针刺fMRI研究相比较，以进行针刺机理的探讨。

足三里穴是足阳明胃经的合穴，是补益要穴，是最常用的治疗穴位之一，它位于膝关节附近，离颅脑较远，针刺操作不影响颅脑fMRI成像，因此本课题选用足三里穴。

针刺左侧足三里穴可以观察到在针刺刺激时，右侧中央后回、左侧中央前回、双侧岛叶、楔前叶、右侧颞叶激活;额叶、顶叶、枕叶、扣带回散在多数负激活点。

中央后回为躯体感觉区，虽然实验猴处于麻醉状态，针刺刺激仍可以引起对侧躯体感觉区的激活。中央前回主要作为躯体运动功能区，针刺足三里穴引起同侧的中央前回的激活。双侧岛叶、楔前叶有较密集的激活，推测与针灸的复杂机理有密切的关系。

针刺左侧足三里穴引起的负激活在额叶、顶叶、扣带回较多而散在，说明负激活的定位性较差，投射关系分散，引起的效应广泛。针刺足三里穴可观察到扣带回的负激活，扣带回属于边缘系统，边缘系统在内脏调节、情绪反应、疼痛处理、情感认知等方面具有重要意义，推测针刺引起的扣带回的负激活在针刺机理及针灸止痛中有重要作用。

针灸作为传统医学的一个重要组成部分，许多研究表明了针灸对于神经、免疫系统有一定的调节作用，因此针灸机理可能是通过自主神经系统、神经免疫调节、体液免疫调节等复杂的过程来发挥治疗作用的，应用fMRI所观测到的只是其复杂反应过程的一部分，并不能反应其全部，针刺时不同个体之间的差异可能较大，同一个体的重复的针刺也可能反映结果并不完全相同。

3．3 麻醉的影响

本实验中，为使食蟹猴颅脑位置固定，对食蟹猴进行了麻醉。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛联合麻醉的方法。氯胺酮是一具有镇痛作用的全麻药。可选择性抑制丘脑内侧核，阻滞脊髓网状结构束的上行传导，兴奋边缘系统。氯胺酮起效快，苏醒迅速。水合氯醛是催眠和抗惊厥药，催眠作用温和，引起近似生理性睡眠，不缩短REMS睡眠时间，无明显后遗作用。上消化道或直肠给药均能迅速吸收，1小时达高峰，维持4～8小时。

麻醉剂影响到神经系统的功能和化学递质的释放，可能部分影响fMRI的结果，本实验研究的是在氯胺酮和水合氯醛联合麻醉下的针刺刺激的fMRI成像。

3．4 本研究结果表明，可以在临床使用的MRI设备上对非人灵长类动物进行脑fMRI的研究。在麻醉状态下，针刺食蟹猴左侧足三里穴，fMRI可以显示不同脑组织区域的正激活和负激活。从正激活方面来看，针刺的作用机理可能与中央前回、岛叶及颞上回有较密切关系。针刺足三里穴引起的负激活定位性较差，投射关系分散，引起的效应广泛。扣带回的负激活在针刺机理及针灸止痛中可能有重要作用。

［1］ Black K J，Koller J M，Snyder A Z，et al．Atlas template images for nonhuman Primate neuroimaging:baboon and macaque［J］．Methods in Enzymology，2004，385(11):91－102．

［2］ Hui K K，Liu Jing，Marina O，et al．The integrated response of the human cerebro－cerebellar and limbic systems to acupuncture stimulation at ST 36 as evidenced by fMRI［J］．NeuroImage，2005，27(3):479－496．

［3］ Litscher G，rachbauer D，Ropele S，et al．Acupuncture using laser needles modulates brain function:first evidence from functional transcranial Doppler sonography and functional magnetic resonance imaging［J］．Lasers in Medical Science，2004，19(1):6 －11．

［4］ Cho Z H，Chung S C，Jones J P，et al．New findings of the correlation between acupoints and corresponding brain cortices using functional MRI［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(5):2670 －2670．

［5］ 尹岭，金香兰，石现，等．针刺足三里穴PET和FMR I脑功能成像的初步探讨［J］．中国康复理论与实践，2002，8(9):523－524．

［6］ WU M －t，Hsieh J C，Xiong J，et al．Central nervous pathway for acupuncture stimulation:localization of processing with functional Mr imaging of the brain－ －preliminary experience［J］．Radiology，1999，212(1):133－141．

［7］ Lee J D，Chon J S，Jeong H K，et al．The cerebrovascular response to traditional acupuncture after stroke［J］．Neuroradiology，2003，45(11):780－784．

［8］ KONG Jian，MA Lin，GOLLUB R L，et al．A pilot study of functional magnetic resonance imaging of the brain during manual and electroacupuncture stimulation of acupuncture point(LI－4 Hegu)in normal subjects reveals differential brain activation between methods［J］．Journal of Alternative and Complementary Medicine(New York，N．Y．)，2002，8(4):411 －419．

［9］ LI Geng，CHEUNG R T，MA Qi－ yuan，et al．Visual cortical activations on fMRI upon stimulation of the vision－implicated acupoints［J］．Neuroreport，2003，14(5):669 － 673．

［10］ WU Ming－ting，SHEEN J M，CHUANG K H，et al．Neuronal specificity of acupuncture response:a fMRI study with electroacupuncture［J］．NeuroImage，2002，16(4):1028 －1037．

［11］ Li，LIU Q，L H，et al．R 工 et al．An fMRI study comparing brain activation between word generation and electrical stimulation of language implicated acupoints［J］．Hum Brain Mapp，2003，18(3):233－238．

［12］ LI Q huang － l，Cheung R T．Cortical activations upon stimulation of the sensorimotor－ implicated acupoints［J］．Magnetic Resonance Imaging，2004，22(5):639－644．

［13］ Yoo S S，Teh E K，Blinder R A，et al．Modulation of cerebellar activities by acupuncture stimulation:evidence from fMRI study［J］．NeuroImage，2004，22(2):932 －940．

［14］ Nap adow M N，LIU J．Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI［J］．Human Brain Mapping，2004，24(3):193－205．

［15］ LIU W C，Feldman S C，Cook D B，et al．fMRI study of acupuncture － induced periaqueductal gray activity in humans［J］．Neuroreport，2004，15(12):1937－1940．

［16］ ZHANG Wei－ ting，JIN Zhen，CUI Guo － hong，et al．Relations between brain network activation and analgesic effect induced by low vs．high frequency electrical acupoint stimulation in different subjects:a functional magnetic resonance imaging study［J］．Brain Research，2003，982(2):168－178．

［17］ 金香兰，尹岭，刘买利，等．针刺大鼠三里穴脑fMRI成像的初步研究［J］．中国康复医学杂志，2003，18(12):715 －718．

［18］ 吴志远，缪飞，项琼瑶，等．针刺足三里对磁共振脑功能成像影响的研究［J］．中国中医药科技，2007，14(5):305 －307．

［19］ 周诚，王嘉洲，陈敏，等．针刺穴位与大脑皮层之间关系的脑功能 MRI表现［J］．中华放射学杂志，2005，39(3):252 －255．

［20］ 肖叶玉，吴仁华，裴仁全，等．针刺足三里穴磁共振功能成像的初步探讨［J］．实用放射学杂志，2004，20(2):106 －108．