牡丹江地区朝鲜族高血压人群中BKβ2R多态性分析

宋 洁 孙 凯 张书捷 鲁 双 李翠萍 韩彦龙 卜晓波

(牡丹江医学院生物教研室，黑龙江 牡丹江 157000)

中国各地区高血压患病率总体上是北高南低，由东北向西南递减，且原发性高血压在不同民族中的发病率不同，提示遗传背景与高血压患病存在着一定的联系〔1〕。缓激肽(BK)是重要的血管活性物质之一，通过缓激肽β2受体(bradykinin receptorβ2，BKβ2R)介导发挥作用。朝鲜族人群高血压的发病率居全国56个民族前列，中国牡丹江地区为心血管疾病高发区并为朝鲜族人群聚居区。本研究以BKβ2R为候选基因，探讨其多态位点与朝鲜族原发性高血压的关系。

1 对象与方法

1.1 样本采集 高血压组取自2008～2011年于牡丹江市朝鲜民族医院内科就诊的原发性高血压患者，均为世居牡丹江的朝鲜族人群，三代血亲内无其他民族。符合1999年《WHO/ISH1999高血压指南》制定的高血压诊断标准〔2〕，且排除糖尿病、冠状动脉硬化性心脏病、肾衰竭和继发性高血压者。共纳入313例患者，年龄 (58.7±9.2)岁，血压145.9/100.7 mmHg。

正常对照组取自2008年于牡丹江市朝鲜民族医院门诊体检的健康人，无高血压病家族史，体格检查及常规化验未见异常，共纳入202名，年龄 (56，4±10.2)岁，血压115.3/77.1 mmHg。各组受试者均无血缘关系，均了解实验目的和内容，并自愿参加实验。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 取冻存乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝静脉血全血300 μl，用杭州博讯公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，－20℃保存备用。参照Braun等〔3〕设计，委托上海生工生物工程公司合成引物，上游:5′－GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG－3′， 下 游:5′－CCTCCTCGGAGCCCAGAAG－3′。PCR 反应体系为 25 μl，其中模板 DNA 50 ng(1 μl)，引物各10 pmol/L(各 1 μl)，2 × TaqMiX 12.5 μl:MgCl2终浓度为2 mmol/L、Taq酶0.6 U、dNTP为0.2 mmol/L，双蒸水9.5 μl，反应混合物混匀后瞬间离心，94℃预变性5 min，继之32个循环，每个周期94℃变性60 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸60 s，末次循环后72℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.2.2 单链构向多态性(single strain conformation polymorphism，SSCP) 取10 μl PCR产物加入5倍体积的变性液，煮沸变性10 min后立即冰浴。上样于20%非变性聚丙烯酰胺凝胶(电泳缓冲液为2×TBE)，进行室温，恒功率3 W 电泳20～24 h，电泳结束后，凝胶进行硝酸银染色并拍照分析。

1.2.3 PCR产物测序分析 对SSCP中检测到的不同带形的样本进行PCR扩增，对PCR产物克隆，菌液送北京恒博和泰生物科技公司进行测序，确定为胸腺嘧啶(T)还是腺嘌呤(C)。

1.3 统计学方法 应用SSCP13.0统计软件，计量资料以±s表示，经Hardy－Wenberg遗传平衡定律检验各基因型和等位基因分布频率已达遗传平衡，基因型和等位基因频率在各组间的比较采用χ2检验，一般项目比较采用t检验。

2 结果

2.1 高血压组与对照组一般资料比较 两组年龄、性别差异均无显著性意义(P＞0.05)。高血压组的体质量指数及血压均明显大于正常对照组(P＜0.01)，在生化指标中，高血压组的总胆固醇明显高于正常组(P＜0.05)，而血糖和血脂含量在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 PCR－SSCP电泳及测序结果 高血压患者和正常组的DNA标本经PCR扩增，得到产物为122 bp的片段。经SSCP分析，产生3种基因型CC型纯合子、TT型纯合子和CT型杂合子，PCR产物经克隆及测序证实存在T－C置换。见图1，图2。

2.3 牡丹江地区人群BKβ2R基因－58T/C基因型和等位基因的分布 在牡丹江地区，BKβ2R基因 －58T/C多态性 TT、CT、CC基因型分布在高血压人群和正常人群间差异无显著性意义(P＞0.05)。T，C等位基因频率在高血压人群和正常人群间差异也无显著性意义(P＞0.05)。见表2。

表1 高血压组与对照组临床指标比较(±s)

表1 高血压组与对照组临床指标比较(±s)

313 202年龄 58.7±9.2 56.4±10.6男/女(n) 160/153 103/99体重指数(BMI，kg/m2) 26.4±4.27 22.8±3.79收缩压(SBP，mmHg) 145.9 ± 16.94 115.3±10.2舒张压(DBP，mmHg) 100.7± 11.3 77.1±9.58总胆固醇(mmol/L) 5.4±1.12 4.78±0.58甘油三酯(mmol/L) 2.25±1.34 2.19±1.06血糖(mmol/L)n 5.01±1.56 4.98±1.71指标 高血压组 正常对照组

表2 BKβ2R基因－58T/C突变基因型及其等位基因频率在牡丹江地区人群中的分布〔n(%)〕

图1 BKβ2R基因启动子区PCR产物琼脂糖电泳结果

图2 PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

3 讨论

BK是迄今发现的体内最强的血管舒张物质之一，直接扩张血管，对抗血管紧张素、去甲肾上腺素的缩血管作用，促进内源性舒血管物质的产生，其生理作用主要是通过存在于绝大部分组织器官β2受体介导的。BKβ2R属于G蛋白耦联受体，相对分子质量41696 Da，基因位于染色体14q32.2，含有3个外显子，编码364位氨基酸。1995年 Braun等〔3〕对人类 BKβ2R基因多态性位点的研究证实3个外显子和1个启动子区存在4种多态性。1999年Madeddu等〔4〕在对人类转BK受体基因鼠和BK受体基因敲除鼠大动脉内注射BK实验中，发现转基因鼠血压明显降低，而基因敲除鼠无明显变化，提示 BK和BKβ2R在血压表型中具有重要作用。

关于BKβ2R基因多态与原发性高血压相关性研究报道主要集中在 BKβ2R基因启动子区 －58位 T/C多态的研究。Mukae等〔5〕对日本，Gainer等〔6〕对非洲裔美国，王兵等〔7〕对中国汉族的高血压和正常血压人群基因多态性分析，发现在高血压患者中启动子区－58等位基因的差异明显，高血压患者组中CC基因型和C等位基因分布频率明显高于正常对照组。但是在朝鲜族人群研究还未见报道。朝鲜族人具有独特的生活方式如高饮酒，高盐饮食(腌菜、泡菜)等，为高血压患病的高危环境因素，导致朝鲜族为我国56个少数民族中高血压患病率最高的四个民族之一。因此在牡丹江地区开展朝鲜族人群原发性高血压分子遗传学研究具有重要意义。通过实验数据发现中国牡丹江地区朝鲜族原发性高血压患者CC、CT、TT;C、T基因型频率及基因频率与正常对照组差异无统计学意义，C、T等位与正常对照组有差异统计学意义，说明BKβ2R基因启动子区－58位T/C多态性与中国牡丹江地区朝鲜族人原发性高血压可能无关，这与对北爱尔兰和法国人群的多中心病例对照(ECTIM)研究、中国新疆哈萨克族人群〔8，9〕和原发性高血压患者的研究结果一致，而与日本、非洲裔美国人及中国汉族人群的研究结果不一致。

在本研究中C等位基因频率在高血压组为0.487，低于以往报道亚洲日本人群C基因频率是0.575，非洲裔美国人C基因频率分别是0.62，中国汉族人群等位基因C为0.58。但高于新疆哈萨克族人群0.47，反映了不同种族基因型频率存在差异。Madeddu等的研究发现BKβ2R基因敲除鼠的盐敏感性增加，德国科学家Braun等〔10〕发现－58T等位基因转录效率较－58C略高，提示启动子区－58C等位基因型降低BKβ2R基因转录效率导致高血压。BKβ2R基因启动子区－58C/T多态性虽然在朝鲜族原发性高血压人群和正常的朝鲜族人群的频率无显著差异，但是－58C等位基因的低频率的数据显示了朝鲜族群体的高血压的高危遗传因素。虽然本文选择的研究对象为无异族通婚的牡丹江地区朝鲜族人群，并严格限定了入选标准，所选样本具有群体代表性。但在朝鲜族高血压人群中的作用需在不同地区加大样本做大量的调查检测。

综上，BKβ2R基因启动子区－58位T/C多态性与中国牡丹江地区朝鲜族人原发性高血压无关，不是朝鲜族原发性高血压的主要遗传因素。可见，基因多态性与原发性高血压相关性具有种族、民族特征，不同人群的原发性高血压遗传背景也不尽相同。

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