冰冻亚型红细胞的保存及应用

(焦作市中心血站，河南焦作 454000)

低温生物学原理应用于红细胞保存，可使红细胞寿命长达10 a，甚至延长到21 a［1］。随着此项技术的不断发展和成熟，目前冰冻亚型红细胞在临床上应用广泛。近年来，我们将冰冻保存技术用于ABO亚型血标本选择及保存，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 57.1%复方甘油溶液、9%NaCl注射液(北京博得桑特输血器材公司);0.9%NaCl注射液、抗-A、抗-B、抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-M、抗-N、抗-P1(上海血液生物医药有限责任公司);1.6%NaCl溶液(由9%和0.9%NaCl注射液按比例配制);无抗凝剂的真空采血管、PVC冷冻管、一次性塑料吸管(浙江拱东医疗科技有限公司);一次性注射器(河南曙光医疗器械集团);Eppendorf移液器(上海富众生物科学有限公司);MDF-192型－80℃低温冰箱(大连三洋冷链公司);HH.W21.600型电热恒温水浴箱(北京光明医疗仪器厂);LD5-2A型台式离心机(北京雷勃尔公司)。

1.2 冰冻亚型红细胞制备 血液标本选择:＜6 d，抗凝良好;弱A、弱B与人源抗A、抗B的凝集强度为1+～2+s;各种传染性指标检测为阴性。①红细胞甘油化:将血液标本离心后去血浆，得到浓缩红细胞;用移液器将红细胞准确转入真空采血管，加塞(转入红细胞的体积占真空采血管容量的20%为宜，以防加甘油混匀时产生的气体冲开瓶塞);用注射器按1∶2抽取甘油溶液，针头穿入胶塞缓慢加入，边加边水平混匀;水平放置，室温平衡30 min;离心去除多余甘油，混匀后分装于PVC冷冻管，注明日期、血型及分装量;平放入－80℃冰箱冰冻保存(标本量较大时，可用转移袋进行甘油化，经适当分装后冰冻保存)。②解冻融化:取出冰冻红细胞，迅速投入37℃水浴，轻轻摇动使其融化;继续放置10 min使其复温。③洗涤去甘油:将复温红细胞转入真空采血管;根据红细胞冰冻时的分装量，用注射器按1∶0.5抽取9%NaCl注射液，针头穿入胶塞缓慢加入，边加边水平混匀;室温平衡5 min，离心去上清;按1∶1加入 1.6%NaCl溶液，操作同前，平衡 5 min，离心去上清;打开胶塞，用一次性塑料吸管加入适量0.9%NaCl注射液(速度不需限制)，混匀后平衡5 min，离心去上清，重复操作1次;以MAP保存液稀释为3～5%的红细胞悬液，根据需要分装于真空采血管中，于2～6℃冰箱保存备用。

1.3 冰冻亚型红细胞相关质量指标检测 ①制备效果:于冰冻亚型红细胞制备的0 d由本站质控科用血细胞计数仪测定并计算红细胞回收率，用邻甲联苯胺法测定上清Hb、体外溶血率，用过碘酸钠法测定甘油残留量;由笔者对红细胞的 A、B、D、C、c、E、e、M、N、P1抗原进行检测并与冰冻前进行对比。②储存稳定性:分别于冰冻亚型红细胞保存的10、20、30 d 进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件，两数比较，均采用χ2检验，计量数据以±s表示。检验水准 α =0.05。

2 结果

冰冻亚型红细胞制备0 d及保存10、20、30 d时，质控科对相关质量指标的抽检结果均符合GB18469的要求［2］，见表1。由表1可见，各项目各时点比较均无统计学差异。对红细胞A、B、D、C、c、E、e、M、N、P1抗原进行检测，其抗原反应的稳定性良好，抗血清的凝集强度与冰冻前对比均无明显变化，与文献报道一致［3］。

表1 冰冻亚型红细胞相关质量指标的抽检结果(n=10， ± s)

表1 冰冻亚型红细胞相关质量指标的抽检结果(n=10， ± s)

观察项目0 d 10 d 20 d 30 d红细胞回收率(%)82.80 ±2.31 － － －上清 Hb(g/L) 0.49 ±0.05 0.49 ±0.11 0.54 ±0.03 0.67 ±0.10体外溶血率(%) 16.10 ±3.34 17.00 ±3.84 19.10 ±0.35 20.70 ±0.69甘油残留量(g/L)4.12 ±1.27 － － －

3 讨论

本研究以真空采血管和一次性注射器作为基本器材，对小量ABO亚型血标本进行甘油化和梯度盐水洗涤，甘油和NaCl溶液的加入量及加入速度容易控制，不需无菌条件，更无需特殊设备，操作简单，成本低廉;制备的冰冻亚型红细胞质量稳定可靠，用含有葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP保存液，可正常使用30 d。目前，冰冻储存的ABO亚型标本共有23 例，分别为 1A2、2A2B、1A3、2B3、1Ax、3Bx、2AxB、5ABx、6B(A)，其中部分为家系调查标本。

用该方法制备的冰冻亚型红细胞主要用于以下方面:①作为参考品对抗-A、抗-B试剂进行选择:笔者曾对本地区使用的6家单克隆抗体试剂进行质量评估，其中包括用7个亚型红细胞检测抗体对弱抗原的识别敏感性，结果表明6家单克隆抗体试剂的效价、亲和力及亚型标本检出率均存在一定差异。最为意外的是，某厂家的单克隆抗体试剂因效价高、亲和力强而被许多单位长期使用，但该试剂对7份亚型标本的检出率却为0，充分证明单克隆抗体试剂确实可导致亚型漏检［4～6］，应引起使用单位及生产厂家的注意。本站从中选择了两家凝集效价高、亲和力强、亚型标本检出率高的试剂，分别用于体采科初检和检验科复检，在一定程度上提高了亚型检出率。②用于某些ABO亚型的鉴定:由于试剂红细胞的保存期只有3个月，而基层血站血型室的标本量因相对较少，往往使试剂利用率偏低，过期报废现象严重，对使用频率较低的红细胞试剂，许多血站干脆就等有标本时再购买或直接将标本送上级采供血机构进行鉴定，有时会延误患者的诊断和治疗，也不利于工作人员检测技术的提高。如果使用冰冻亚型红细胞，就有可能解决这个问题。前期我站曾从无偿献血者中发现的2例B(A)血型，血清学鉴定无法区分AxB、B(A)，但B(A)血型的血清中因同时含有抗-A和抗-A1，所以除了与A1红细胞凝集外，与A2红细胞也凝集是其区别于AxB的特征之一，笔者使用冰冻的A2和A2B红细胞进行检测，将结果确定为B(A)血型。随后将标本快递至上海市血液中心进行分子生物学确认，2名献血者均被证实为B(A)血型，基因型分别为B(A)02/O和B(A)04/O。③作为弱阳性质控品用于检验科的血型鉴定(应选择储存量比较大的标本)。如反应结果为阴性，提示可能存在导致亚型漏检的影响因素，比如加样量、试剂浓度、震荡悬浮频率等，应及时分析并纠正。④作为实验标本用于对医院供血库进行血型血清学质控考评，也用于全市和站内输血专业技能竞赛。近年来大量基层一线工作者血型血清学的基础知识和基本技术薄弱［7］，在ABO亚型检测中表现的尤为突出，亚型漏检率高，从而导致ABO定型错误并发生严重的输血反应［8～10］，给安全输血带来一定困扰。我们将亚型红细胞反复用于质控考评和技能竞赛，一方面可强化工作人员的亚型概念，另一方面也使工作人员比较直观地认识并了解亚型的血型血清学特点，以利于发现并检出亚型。笔者统计了2006年1月～2009年12月本市79 704例无偿献血者的亚型检出率仅为0.25/万，而2010年1月 ～2011年12月61 332例无偿献血者的亚型检出率却为1.48/万，亚型检出率明显提高。同时，医院供血库送检的亚型标本也逐渐增多。

综上所述，冰冻亚型红细胞的应用对提高本地区ABO亚型检测的整体水平，进一步保障临床输血安全有一定的促进作用。

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［4］方建华，刘玉振，温涛.国产单克隆抗体试剂漏检AX1例［J］.中国输血杂志，2004，17(2):119.

［5］徐洪卫.街头无偿献血漏检AXB亚型1例［J］.临床输血与检验，2006，8(1):57.

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［10］刘建岭，刘乐霞，肖玮，等.1个回族家系中发现8例B(A)亚型报告［J］.中国输血杂志，2010，23(7):553-555.