浙贝母遗传多样性的ISSR分析

周 洁，王忠华

(1.浙江理工大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018;2.浙江万里学院生物技术研究所，浙江 宁波 315100)

贝母(Fritillaria L.)属于百合科(Liliaceae)多年生草本植物。中药贝母为干燥鳞茎，《中华人民共和国药典》(2005版)将其分为土贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、浙贝母和湖北贝母6大类［1］。浙贝母根据分类学的不同又分为大贝、中贝、小贝，或者分为为狭叶贝母、宽叶贝母、多籽贝母。浙贝母是浙江重要道地中药材“浙八味”之一，具有极高的药用价值。中医认为其苦、寒，归肺、心经，具有清热散结、化痰止咳功能。至20世纪90年代，经过对其药理作用的深入研究，认为浙贝母具有镇咳、祛痰、松弛气管平滑肌、镇痛抗炎、活血化瘀、溶石、抗溃疡、止泻、抗菌、抗肿瘤等作用［2］。浙贝母原产于浙江宁波象山，而目前，其栽培基地主要分布于鄞州、磐安、缙云等地区，年栽培面积达3.97万hm2。现在，磐安地区已成为浙贝母主要产地，同时也是浙贝母良种选育与种苗输出的重要基地，面积在300 hm2以上［3］。但实际调查发现，磐安地区的浙贝母存在种质资源混杂的现象，这对浙贝母的育种产生不良的影响。本文针对磐安地区的浙贝母进行品种及种内遗传多样性研究，为新品种选育奠定基础。

简单序列重复区间ISSR(inter-simple sequence repeat)是一种基于微卫星系列的分子标记技术，它结合了随机引物扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记技术的优点，与以往的分子标记相比，能够提供更多的基因组DNA信息。此方法现已广泛应用于药用植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等方面研究［3］。

1 材料和方法

1.1 样品采集

本文的浙贝母材料采自浙江磐安新渥、浙江磐安双峰、浙江磐安宅口村等种植基地。材料的来源及品种名称分别为磐安狭叶贝母、南通小贝、磐安双峰狭叶贝母、磐安新渥大贝、磐安新渥多籽贝、磐安宅口狭叶贝母、磐安新渥中贝、磐安新渥多籽贝、磐安新渥中贝、磐安新渥中贝、磐安新渥本地大贝和磐安新渥本地大贝，编号分别为1—10。

1.2 浙贝母基因组DNA提取

采用改良CTAB法进行浙贝母基因组DNA的提取，具体操作如下:取新鲜叶片0.1 g，用液氮研磨成粉末，放入1.5 mL的 EP管中，加入800 μL预热的CTAB提取缓冲液，混匀后65℃水浴1 h，13 000 r·min－1离心 15 min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻混匀，13 000 r·min－1离心15 min，重复此步骤1次;取上清，加入2/3体积的异丙醇，放入－20℃冰箱30 min 沉淀 DNA;13 000 r·min－1离心10 min，倒掉上清液，再加入200 μL 70%乙醇洗涤DNA 2～3次;将1.5 mL Ep管倒置于通风柜里，使 DNA尽量干燥;加入 500 μL的 TE，溶解 DNA;置于4℃冰箱保存，备用。DNA质量用0.8%琼脂糖电泳检测，DNA纯度和浓度通过紫外吸收法测定。

1.3 ISSR-PCR扩增

经过比较和优化，ISSR-PCR的反应体系为:10 × PCR Buffer 2 μL，25 mmol MgCl22 μL，10 μmol 引 物 1 μL，dNTP 1.6 μL，ddH2O 12.5 μL，Tag 酶 0.4 μL 和模板 DNA 0.5 μL。

扩增反应:94℃ 预变性5 min;94℃变性45 s，50 ～ 60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 90 s，35个循环;72℃ 延伸10 min;4℃ 保存。

ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列(http://www.biotech.ubc.ca/serices/naps/primers/primers.pdf)，由上海生工合成。从30个引物中筛选出7个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR分析。

1.4 扩增产物检测

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，以2 000 bp marker作为标准分子量对照，在120 V稳定电压条件下电泳1.5 h左右，再用EB染色15～20 min后，用凝胶成像仪拍照。

1.5 数据分析

在琼脂糖凝脂电泳图谱上，电泳条带按有或无记录，电泳条带清晰的赋值为1，否则赋值为0。用NTSYS-PC(version 2.10)软件系统计算材料间遗传相似系数(GS)。并通过非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，建立亲缘关系图［4］。

2 结果与分析

2.1 扩增产物的多态性分析

采用30个ISSR引物对随机选择的2份贝母材料进行PCR扩增，从中筛选出7个稳定性强、重复性好、多态性丰富的引物对所有贝母材料进行扩增。扩增结果见表1。

表1 ISSR引物序列及扩增产物多态性

从ISSR扩增条带统计结果来看，7个引物共得到483条扩增带，其相对分子质量在200～2 000 bp，其中多态性带315条，多态性条带百分率为65.22%，不同引物扩增出的清晰条带数在5～10，平均每个引物扩增出的片段条数为7.9条，扩增的多态性条带数范围为3～9，每个引物的多态性百分率为50% ～100%，平均每个ISSR引物扩增出的多态性条带的数目为6，其中引物815，895的扩增结果如图1所示。

图1 引物UBC815、UBC895 ISSR-PCR扩增结果

2.2 遗传相似系数分析

本试验收集了不同产地、品种的浙贝母，分析这些不同产地、不同品种间的遗传多样性，遗传相似系数统计结果如表2所示。

表2 浙贝母遗传相似系数分析结果

表2结果发现，所有贝母材料间的GS平均值为0.639 9，变化范围为0.433 3～0.933 3，其中南通小贝和磐安双峰狭叶贝母的GS(0.933 3)值最大，这表明其遗传相似性最高，遗传分化很小。而南通小贝和磐安新渥大贝、磐安新渥本地种大贝间的GS(0.433 3)最小，同时磐安新渥本地大贝和磐安双峰狭叶贝母、南通小贝、磐安新渥多籽贝间的GS(0.433 3)也是最小。由此表明，南通小贝和磐安新渥大贝之间，磐安新渥本地种大贝与南通小贝、磐安双峰狭叶贝母、磐安新渥多籽贝之间的遗传相似性最小，发生了较大的遗传分化。

2.3 亲缘关系聚类分析

根据ISSR标记计算的遗传相似系数矩阵，采用NTSYS 2.10软件按UPGMA法构建8份材料的亲缘关系聚类分析结果(图2)。

图2 浙贝母亲缘关系聚类结果

从图2可看出，8份浙贝母种质可以分为两大类群:第1大类群包括磐安狭叶贝母、磐安新渥大贝和磐安本地种大贝，其中磐安新渥大贝和磐安新渥本地大贝聚为1类，这说明磐安大贝的遗传分化程度较小;第2大类群则包括南通小贝、磐安双峰狭叶贝母、磐安新渥多籽贝、磐安宅口狭叶贝母和磐安新渥中贝。

3 小结和讨论

试验表明，经过挑选后的ISSR引物扩增后，DNA多态性好，条带清晰，且聚类结果可以将所有材料区分开。由此可见，ISSR标记技术适合用于浙贝母种质资源的鉴定与遗传多样性研究。从实验结果来看，不同浙贝母材料的遗传多样性平均值为0.639 9，变化范围在0.433 3～0.933 3。这表明磐安的浙贝母种质资源间存在较丰富的遗传多样性。根据实地调查发现，浙江磐安栽培的浙贝母都是群体内将选留的鳞茎进行种植，即营养繁殖，这是导致栽培的浙贝母种群间遗传分化的最大的原因。不同产地，相同的品种如狭叶贝母经过不同地方的种植，遗传相似性较小，如磐安狭叶贝母与磐安双峰狭叶贝母GS仅为0.500 0，与磐安宅口村的狭叶贝母GS为0.616 7，这也许与长期隔离发生的遗传分化有关。磐安产浙贝母资源不仅在种间存在着遗传差异，种内也存在着遗传多样性。如磐安新渥多籽贝种内GS为0.816 7，磐安新渥中贝种内GS为0.783 3，而磐安新渥本地种大贝种内的遗传差异最大，GS值为0.500 0，这可能由于种质资源混杂造成的。因此，利用遗传因素来区分种质，寻找合适的育种资源，以减轻种质资源混杂现象是必要的。另外，在浙贝母的生产过程中，控制不同品种栽培群体的传播，也是避免混杂的一种途径。

随着科学技术的发展，对中药材种质资源的鉴定从最初的形态学鉴定到细胞学标记技术即核型分析和解剖学鉴定;然后是生化大分子标记包括同功酶和蛋白质指纹标记;也有通过化学成分进行种质鉴定和分类［5］。但这些方法由于本身的限制不能直接地反映种质的遗传特性。近来发展起来的分子标记技术使得分子水平的鉴定成为可能，并得到了广泛的应用。2006年，李玉锋等［6］采用 RAPD这种分子标记技术对8种贝母种进行鉴定。2009年，陆含等［7］也采用 RAPD对浙贝母进行鉴定。但由于RAPD的重现性较差，对种间和近缘属间亲缘关系研究有较大的局限性。目前，主要是运用ISSR标记法对浙贝母进行鉴定。如2010年，刘晓贤等采用ISSR-PCR技术对浙贝母种质进行遗传分析。另外，也有采用AFLP对浙贝母进行种质的遗传多样性分析，如2010年徐金中等［8］对浙江主产区栽培的浙贝母进行的遗传多样性分析。现在，更为准确的分子鉴定技术也渐渐发展起来，如对核糖体ITS序列，叶绿体基因组rbcL，trnL2F，matK序列的研究等。因此，针对浙贝母的种质资源的鉴定、亲缘关系研究等问题，在未来几年内可采用这些新兴的分子标记技术进行研究与育种应用。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典(第一卷)［M］．北京:化学工业出版社，2005:205．

［2］张明发，沈雅琴．浙贝母药理研究进展［J］．上海医药，2007，10(28):459－461．

［3］王明明，宋振巧，王建华．ISSR标记技术及其在药用植物遗传育种中的应用［J］．中草药，2007，38(1):134－137．

［4］黎开强，吴卫，郑有良，等．川产贝母种质资源遗传多样性的ISSR分析［J］．中国中药杂志，2009，34(17):2149－2154．

［5］程远辉，张兴翠．分子标记技术在中药鉴定中的应用［J］．现代中药研究与实践，2006，20(2):58－60．

［6］李玉锋，唐琳，陈放．8种贝母的 RAPD分析［J］．中成药，2006，28(10):1528－1529．

［7］陆含，朱世华，周书军，等．浙贝母4品种及5种贝母遗传多样性的 RAPD分析［J］．宁波大学学报:理工版，2009，22(1):44－47．

［8］徐金中，张红叶，马喜彦，等．浙江主产区栽培浙贝母种质遗传多样性的 AFLP分析［J］．中草药，2010，41(1):109－113．