除湿止痒洗液微生物限度检查法的验证

孟丽丽 ，陆 娟 ，肖 静

(1.湖北省医药学院附属医院·襄阳市第一人民医院，湖北 襄樊 441000;2.湖北省襄阳市食品药品检验所，湖北 襄樊 441000)

除湿止痒洗液是由蛇床子、黄连、黄柏、白鲜皮、苦参、虎杖、紫花地丁、地肤子、萹蓄、茵陈、苍术、花椒、冰片等组成的复方洗剂，具有清热除湿、祛风止痒的作用，可用于急性、亚急性湿疹证属湿热或湿阻型的辅助治疗。笔者根据2010年版《中国药典(一部)》附录中对微生物限度检查法验证的要求[1]，采用常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法对其进行微生物限度检查法的验证，现将结果报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司);HTY－2000B型集菌仪，集菌培养器(杭州泰林公司);PXY－120型电热恒温干燥箱(连云港千樱医疗设备有限公司);LRH－250－A生化培养箱(广东医疗器械厂);生物安全柜(苏净安泰公司)。除湿止痒洗液(四川通园制药公司，批号为110403，110404，110410，规格为200 mL)。

1.2 菌种与培养基

大肠埃希菌[CMCC(B)44102];金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003];枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501];铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104];营养琼脂，玫瑰琼脂，营养肉汤，改良马丁培养基，胆盐乳糖培养基。以上菌种与培养基均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 稀释剂与冲洗液

灭菌的0.05%聚山梨酯80－氯化钠蛋白胨缓冲液;0.9%灭菌氯化钠溶液;pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液。

2 方法与结果

2.1 计数方法验证

2.1.1 菌液及供试液制备

菌液制备:接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁斜面培养基上，23～28℃培养 5～7 d，加入 5 mL含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

供试液制备:取供试品10 mL，加入pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液90 mL混匀，制成1∶10的供试液[2]。

2.1.2 试验组

常规法:取1 mL供试液和1 mL试验菌液分别注入平皿，立即倾入相应琼脂培养基，摇匀，待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数。每株试验菌平行制备5个平皿。

培养基稀释法:取0.2 mL供试液和1 mL试验菌液分别注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀，待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数，每种试验菌平行制备5个平皿。

薄膜过滤法:取1 mL供试液，置薄膜过滤器中过滤，用pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗，每次100 mL，冲洗2次。在最后1次冲洗液中加入1 mL试验菌液，取出滤膜菌膜朝上贴在相应培养基上按规定条件培养，每日观察，计算菌落数。

2.1.3 菌液组

取上述试验菌液按平皿法测定每1株菌株所加的试验菌数。

2.1.4 供试品对照组

常规法:取1 mL供试液注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀，待凝固后按规定条件培养，每日观察，计算菌落数，测定供试品本底菌数。

培养基稀释法:取0.2 mL供试液注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀，待凝固后按规定条件培养，每日观察，计算菌落数，每种试验菌平行制备5个平皿。

薄膜过滤法:取1 mL供试液，置薄膜过滤器中过滤，用pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗，每次100 mL，冲洗2次。取出滤膜，菌膜朝上贴在相应培养基上规定条件培养，每日观察，计算菌落数。

2.1.5 稀释剂对照组

取1 mL稀释液和1 mL试验菌液分别注入平皿，立即倾入相应琼脂培养基，摇匀，待凝固后按规定条件培养，每日观察，计算菌落数。每株试验菌平行制备2个平皿。

2.1.6 结果判断

在3次独立的平行试验中(供试品批号分别为110403，110404，110410，试验次数分别标示为 1，2，3，考察不同批次供试品对试验的重复性及稳定性)，稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%，常规法和培养基稀释法试验组的菌回收率均低于70% ，而薄膜过滤法试验组的菌回收率高于70% ，符合2010年版《中国药典(一部)》附录中对微生物限度检查法验证的要求[1]。因此，可照该供试液制备方法和薄膜过滤法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数，结果见表1。

表1 计数检查回收率测定结果

2.2 控制菌检查方法验证

2.2.1 菌液及供试液制备

菌液制备:接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h;用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数为10～100 cfu的菌悬液。

供试液制备:取供试品10 mL，加入pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液90 mL混匀，制成1∶10的供试液。

2.2.2 试验组

常规法:取1∶10供试液10 mL，分别加入100 mL胆盐乳糖培养基和营养肉汤培养基中。分别加入1 mL 10～100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液和铜绿假单胞菌菌液，依药典相应控制菌检查法进行检查。

薄膜过滤法:取1∶10供试液1 mL，置薄膜过滤器中过滤，用pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗，每次冲洗100 mL，在最后1次冲洗液中加入1 mL试验菌液，取出滤膜在相应培养基培养，每日观察，依照相应控制菌检查法进行检查。

2.2.3 阳性对照组

阳性对照组试验方法同供试品的控制菌检查方法，对照菌的加菌量为10～100 cfu。

2.2.4 阴性对照组

取稀释液10 mL照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

2.2.5 结果判断

在3次独立的平行试验中(供试品批号为110403，110404，110410，试验次数分别标示为1，2，3)，阴性菌对照组无菌生长，阳性对照组检出相应的控制菌，常规法试验组未检出试验菌，薄膜过滤组检出试验菌，因此可按薄膜过滤法进行供试品的控制菌检查，结果见表2。

表2 控制菌回收率测定结果

3 讨论

根据2010年版《中国药典(一部)》附录中对微生物限度检查法验证的规定，含抑菌成分的中成药制剂必须消除供试液的抑菌活性，然后再进行微生物限度检查。除湿止痒洗液中的黄连、黄柏等中药材的有效成分均有较强的抑菌作用，笔者对该样品微生物限度检查进行验证，结果表明，用常规法及培养基稀释法检查此类有抑菌作用的样品微生物限度，结果的准确性将受到影响，需要先消除供试液的抑菌活性，再进行检查。采取薄膜过滤法冲洗2次就能较好地排除干扰，因此除湿止痒洗液的微生物限度检查采用薄膜过滤法是切实可行的。

另外，菌液制备好后，应在2 h内使用，如果试验时间紧张，应将菌液保存在冰箱内冷藏，1 d内用完，否则菌液活菌数变化较大，试验结果不准确。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录79.

[2]苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社，2007:303.