高效液相色谱荧光法测定人血浆中顺式阿曲库铵浓度

王述蓉，江启蓉，冯碧敏

(泸州医学院附属医院药剂科，四川 泸州 646000)

顺式阿曲库铵(cis－atracurium)是一种新型中时效非去极化肌松药，是构成阿曲库铵消旋混合物的10种同分异构体之一，其肌松效应和代谢方式与阿曲库铵相似，但肌松强度约为阿曲库铵的3倍。该药起效、恢复快，无蓄积作用，不释放组胺，对心血管系统影响轻，代谢不依赖肝肾功能以及代谢产物无肌松作用，是目前较理想的肌松药，尤其适用于高龄、肝肾功能不全、心血管疾病以及重症监护病房患者[1]。目前测定人血浆中顺式阿曲库铵质量浓度的方法主要有高效液相色谱荧光法(HPLC－FLU)[2]和高效液相色谱质谱法(LC－MS)[3]，后者灵敏度虽高，但仪器昂贵，分析成本较高。本试验中利用乙腈沉淀蛋白后直接进样，操作简单、灵敏、准确，适用于顺式阿曲库铵临床药物代谢动力学的研究。现报道如下。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，包括510型恒流泵、2475荧光检测器、Milliennium2010色谱工作站;AE240型电子天平(Mettler公司);AS10200型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。顺式苯磺酸阿曲库铵对照品(中国药品生物制品检定所，批号为48090107RS);空白人血浆(泸州医学院附属医院输血科);乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Diamonsil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);激发波长:230 nm，发射波长:324 nm;柱温:40℃;流动相:0.04 mol/L磷酸二氢钾(pH=3.0)－ 乙腈(60 ∶40);流速:0.5 mL/min;进样量:20 μL。在上述色谱条件下，被测药物与各杂峰分离良好，顺式阿曲库铵的保留时间为9.4 min(见图1)。

2.2 溶液制备

精密称取顺式阿曲库铵对照品适量，用pH=3.0的硫酸溶液配制成1 g/L的对照品贮备液，置4℃冰箱避光保存。

图1 高效液相色谱图

2.3 样品处理

精密量取血浆样品0.5 mL，加入 pH=3.0的硫酸溶液50 μL，混匀，再加入乙腈 1 mL，涡混 2 min，15000 r/min离心 10 min，取上清液10 μL进样分析。

2.4 方法学考察

标准曲线绘制:用空白血浆分别配制质量浓度为10，20，50，100，250，1250，2500 ng/L 的顺式阿曲库铵血浆标准系列液。按2.3项下方法处理，测定血浆中顺式阿曲库铵质量浓度。以质量浓度(C)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，得线性方程 A=7.234C+0.302，r=0.9990(n=7)。结果表明，顺式阿曲库铵进样质量浓度在10.0～2500 ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。检测限和定量限分别为2.5 ng/mL和10 ng/mL。

精密度试验:用空白血浆分别配制质量浓度为20，100，1250 ng/mL的顺式阿曲库铵质控样品，按2.3项下方法处理，测定顺式阿曲库铵浓度。对3个质量浓度的质控样品进行日内和日间精密度考察，结果见表1。

回收率试验:将所测定高、中、低3个质量浓度的质控样品的峰面积带入标准曲线，计算所得质量浓度，以真实血样质量浓度为标准，将两组质量浓度相比，计算顺式阿曲库铵方法回收率;另以流动相配制相应系列质量浓度的顺式阿曲库铵溶液，直接测定，以此为标准，将两组峰面积相比，计算顺式阿曲库铵提取回收率。结果见表2。

表1 精密度试验结果

表2 回收率试验结果(n=5)

稳定性试验:取低、中、高3个质量浓度(20，100，1250 ng/mL)的质控样品若干份，进行血浆样品冻存、多次冻融、样品处理后室温放置及4℃冷藏放置的考察。样品在－20℃保存2周、连续冻融3次、样品处理后室温保存12 h和样品处理后于4℃保存24 h的情况下，血浆中顺式阿曲库按的回收率均在95%以上，RSD＜4.0%，表明稳定性良好。

3 讨论

分别对200 nm、230 nm和280 nm 3个激发波长进行了比较，发现顺式阿曲库铵保留时间基本相似，但在激发波长230 nm时顺式阿曲库铵的峰面积最大，峰形最好，因此选择230 nm作为荧光的激发波长。顺式阿曲库铵结构中含有酯键和季铵基团，因此本品易水解，且对高温不稳定，故在处理中需用硫酸酸化血浆样品以减少其分解。在流动相中加入磷酸盐缓冲液较好地改善了顺式阿曲库铵的峰形，当流动相组成为0.04 mol/L磷酸二氢钾(pH 3.0)－乙腈(60∶40)时，分离效果较好。综上所述，本试验利用乙腈沉淀蛋白后直接进样，方法简单、灵敏、准确，适用于人血浆中顺式阿曲库铵浓度的测定和药物代谢动力学的研究。

[1]Owens CA，Brakoniecki J.Cisatracurium:a new nondepolarizing neuromuscular blocking agent[J].Conn Med，1996，60(8):461－463.

[2]Imbeault K，Withington DE，Varin F.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a 0.1 mg/kg dose of cisatracurium besylate in children during N2O/O2/propofol anesthesia[J].Anesth Analg，2006，102(3):738－743.

[3]Wang P，Zhang H，Stewart JT，et al.Simultaneous detection of cisatracurium，its degradation products and propofol using positive ion detection followed by negative ion detection in a single LC/MS run[J].J Pharm Biomed Anal，1998，17(3):547－553.