炮制骨碎补的提取及其柚皮苷的纯化研究

马才敬 ，方 谨 ，李玲玲 ，王 允

(1.四川泰华现代中药所，四川 成都 618300; 2.重庆邮电大学，重庆 400065)

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根茎，全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或者再燎去茸毛(鳞片)。骨碎补性味苦温，归肾、肝经，具有补肾强骨、续伤镇痛功效，用于肾虚腰痛、筋骨折伤、耳鸣耳聋、跌打闪挫、牙齿松动，外治斑秃、白癜风等症。槲蕨根茎含淀粉16.4%，葡萄糖5.37%，还含主要活性成分柚皮苷[1]。笔者建立了测定药材中柚皮苷含量的高效液相色谱法，并优化了炮制骨碎补的提取纯化方法，报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪。柚皮苷对照品(由重庆中药研究院提供，批号为110722－200309，供含量测定用);乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。砂炮骨碎补购于南坪医药公司，经重庆邮电大学生物信息学院中药鉴定学刘毅老师确认为槲蕨科骨碎补。

2 方法与结果

2.1 柚皮苷含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Phenomenex C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－水－冰乙酸(27∶72∶1);流速:1 mL/min;柱温:30℃;测定波长:283 nm;进样量:5 μL。在此条件下，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000，保留时间为4.712 min，色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

取本品粗粉约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇30 mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密称取柚皮苷对照品0.6 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含柚皮苷0.6 mg的对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取柚皮苷对照品溶液(0.6 g/L)2，4，6，8，10，12 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积对数值为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=1836X－6.84，R2=0.9998(n=5)。结果表明，柚皮苷进样量在0.1606～0.9638μg范围内与峰面积对数值呈良好的线性关系。

精密度试验:取柚皮苷对照品溶液(0.6 g/L)，连续进样6次。结果峰面积的 RSD=0.282%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验 :取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD=0.247%(n=5)，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品(批号为060316)，依法制备6份供试品溶液，按拟订的色谱条件测定含量。结果含量的 RSD=1.66%(n=6)，表明方法重复性好。

加样回收试验:取同一批已知含量的样品，取9份各1g，精密称定，每3份一组分别精密加入柚皮苷对照品溶液(0.6 g/L)各0.8，1，1.2 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 柚皮苷加样回收试验结果(n=9)

2.1.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液并测定。结果每1 g药材含柚皮苷的量分别为580，584，582 mg。据样品含量测定结果，暂订本品每1 g骨碎补以柚皮苷计不得少于580 mg。

2.2 炮制骨碎补的提取

根据相关文献，骨碎补的提取以水提与60%乙醇提取为主，故分别采用两种方法试验。

水提[2]:取骨碎补药材，用粉碎机将药材打成粉末，取粉末100 g;将粉末用滤纸包裹，再用纱布包裹好，置锅内;将药材包和Ⅱ级蒸馏水按1∶10(W/V)混合，浸泡30 min，常规煎煮2次;以2500 r/min离心10 min;取上清，旋转蒸发浓缩成2 g/mL的药液。

60%乙醇提取[3]:加10倍量的60%乙醇回收提取2次，每次1.5 h，合并提取液，减压回收乙醇，继续浓缩至300 mL，质量浓度相当于2 g/mL。

优选:采用高效液相色谱法测定骨碎补水提液与60%乙醇提取液中的柚皮苷含量，结果见表2。

可见，用水提取骨碎补中柚皮苷的含量与醇提法相差不大，根据生产实际，从经济实用的角度考察，宜采用水提法。

2.3 柚皮苷的分离纯化

根据骨碎补的理化性质，拟订分离纯化工艺分别为水煎醇沉和乙酸乙酯萃取。

表2 不同提取方法对柚皮苷含量的影响

水煎醇沉:取骨碎补药材，用粉碎机粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述优选条件，制成浓缩成100 mL药液;再加95%乙醇171 mL，水煎醇沉;用旋转蒸发仪回收乙醇。

乙酸乙酯萃取:取骨碎补药材，用粉碎机粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述优选条件，制成浓缩成100 mL药液;加乙酸乙酯200 mL，用分液漏斗分液，去上层液体，发现上层液体有一些杂质，抽滤除去杂质;加乙酸乙酯200 mL，同样以分液漏斗分液，用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯。

优选:采用高效液相色谱法测定以上两种纯化的柚皮苷含量，结果水煎醇沉液中柚皮苷含量为25.16%，乙酸乙酯萃取液中柚皮苷含量为77.05%。可见，乙酸乙酯萃取柚皮苷为较优方案。

3 讨论

试验中，曾采用不同体积分数的乙醇提取，结果50%乙醇提取的柚皮苷相对较少，70%乙醇提取的柚皮苷里含有相对较多的杂质，60%乙醇提取的柚皮苷相对含量较高、杂质较少，故选用60%乙醇作为提取溶剂。本试验采用的流动相与2010年版《中国药典(一部)》不同，因为乙腈－水 －冰乙酸(27∶72∶1)在 Agilent 1200型高效液相色谱仪上使用更方便。

[1]唐 琪，陈莉丽，严 杰.骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株MC3T3－E1细胞增殖、分化和钙化作用的研究[J].中国中药杂志，2004，29(2):164－168.

[2]韦英杰，陈 宁，王 静，等.正交实验法优选骨碎补提取工艺的研究[J].时珍国医国药，2004，11(15):750－751.

[3]张 琳，杨中林.水提法与醇提法对骨碎补中总黄酮含量的影响比较[J].江苏药物与临床研究，2004，3(12):30－31.