NOX4在高肺血流肺动脉高压大鼠中表达的意义▲

黄维佳 覃家锦 何 巍 戴 霞 冯 旭 郭建极 冼 磊

(1广西柳州市人民医院心胸外科，柳州市 545001;2广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

NADPH氧化酶产生活性氧导致的氧化应激在许多心血管疾病的发生、发展过程中扮演着重要角色。近年的研究发现，作为血管内皮细胞活性氧主要来源的NADPH氧化酶4(NOX4)，在缺氧性肺动脉高压、新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)的发病机制中有着重要的意义。但到目前为止，NOX4与左向右分流继发的肺动脉高压是否有关尚不清楚。本实验建立左向右分流高肺血流肺动脉高压大鼠模型，观察大鼠肺组织中NOX4表达的变化，旨在初步探讨NOX4在左向右分流型肺动脉高压病理机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠(广西医科大学实验动物中心提供)，多通道生理记录仪(RM-6000，日本)，GASTAT-mini血气分析仪(北京康美)，多通道 PCR仪(PERKINELMER，美国)，凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 实验分组 40只SD大鼠随机分为4组，分别为分流11周组、分流8周组、分流4周组、对照组，每组10只，各分流组大鼠通过腹主动脉－下腔静脉分流法建立高肺血流肺动脉高压大鼠模型，对照组常规开腹但不建立分流，4组大鼠饲养条件相同。

1.3 建模方法 腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，手术切口选取腹部正中切口，钝性游离后腹膜，暴露腹主动脉及下腔静脉，在腹主动脉左肾动脉开口下方及髂总动脉上方，分别用小动脉夹夹闭，于腹主动脉左侧壁用尖刀片挑开1 mm长的切口，用20G套管针以45度角穿透腹主动脉壁进入相邻的下腔静脉内，原则上不刺破下腔静脉对侧管壁，拔出针头，用7-0滑线缝合腹主动脉壁的切口，移走小动脉夹，此时可观察到大鼠下腔静脉变粗，出现微弱搏动，或颜色由暗变红，均提示分流已形成。

1.4 平均肺动脉压(mPAP)的测定 经腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉，游离右颈外静脉，将聚乙烯导管经右颈外静脉插入大鼠肺动脉，导管另一端接压力换能器及多通道生理记录仪，记录mPAP。

1.5 分流量的检测 按照齐建光等［1］介绍的方法，分别抽取大鼠肺动脉、颈外动脉和股静脉血，应用GASTAT-mini血气分析仪测定血氧饱和度，通过以下公式计算左向右分流量:左向右分流量=体动脉血氧饱和度－股静脉血氧饱和度)/(肺静脉血氧饱和度－肺动脉血氧饱和度)。若体动脉血氧饱和度＞95%，肺静脉血氧饱和度按100%估算，体动脉血氧饱和度＜95%时，肺静脉血氧饱和度则按98%估算。

1.6 右心室肥厚指数(RVI)测定 于大鼠心脏大血管根部切断，取出心脏后分离右室游离壁(RV)、室间隔(S)及左室壁(LV)并分别称重，通过公式RVI=［RV/(LV+S)］计算右心室肥厚指数。

1.7 RT-PCR检测肺组织5-HTT mRNA的表达

1.7.1 引物设计 通过NCB I基因数据库查询大鼠NOX4基因cDNA序列(GI:16758287)和内参β-actin基因cDNA序列(GI:42475962)，大鼠 NOX4上游引物:5-TTCCGAGATTTACTACTGC-3;下游引物:5-TGTATCCCATCTGTTTGAC-3，产物大小374bp;β-actin上游引物:5-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3;下游引物:5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3，产物大小 280 bp。

1.7.2 大鼠肺组织总RNA的提取及逆转录聚合链反应取大鼠肺组织100 mg加入1 mL RNA裂解液，剪碎后在冰浴条件下以12 000 rpm/min匀浆。肺组织总RNA提取和逆转录cDNA过程按试剂说明书操作。PCR总反应体系25 μL，94℃预变性5 min后，进行 PCR 热循环:94℃变性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后 72℃再延伸 7 min。计算反应体系中NOX4/β-actin反应产物电泳条带积分光密度(IOD)比值，以该值表示目的基因表达的相对水平。

1.8 统计学方法 统计学分析采用SPSS 13.0软件，实验数据均以mean±SD表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为标准表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠平均肺动脉压力的变化 随着建立模型时间的延长，分流各组大鼠平均肺动脉压逐步升高，分别为(20.9 ±2.2)mmHg(分流 4 周组)、(24.3 ±3.7)mmHg(分流8周组)、(31.2 ±5.5)mmHg(分流 11 周组)，其中分流11周组大鼠存在明显肺动脉高压，与各组间指标比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组分流量的检测结果 对照组左向右分流量为1.08±0.93，而分流11周组、分流8周组、分流4周组分流量分别为2.32 ±0.74、2.18 ±0.33、1.97 ±0.46，三者之间比较无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明各分流组均出现了大量分流，通过腹主动脉－下腔静脉分流手术建立左向右分流肺动脉高压大鼠模型是成功的。

2.3 大鼠右心室肥厚指数的变化 随着建立模型时间的延长，分流各组大鼠右心室肥厚指数(RVI)逐步升高，分别为(35.3 ±4.9)%(分流 4 周组)、(39.6 ±8.3)%(分流8周组)、(49.2±6.8)%(分流11周组)，其中分流 11 周组的改变最为明显，与各组间比较差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

2.4 大鼠肺组织中 NOX4mRNA表达的情况 对照组、4周组、8周组、11周组大鼠肺组织中NOX4 mRNA表达水平分别 为 0.22 ± 0.05、0.27 ± 0.08、0.38 ± 0.11、0.62±0.07，表明随着建立模型时间的延长，分流各组大鼠肺组织中NOX4 mRNA的表达呈现逐步升高的态势，当中11周组NOX4 mRNA的表达最明显，与其余各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图1、图2。

图1 4组大鼠肺组织中NOX4β-actin的显示

图2 4组大鼠肺组织NOX4 mRNA相对水平比较

3 讨论

左向右分流型先天性心脏病合并肺动脉高压是临床常见问题，其严重的后果直接影响到外科手术的成功率和患者术后的生存质量。因此，长期以来先天性心脏病继发肺动脉高压的发病机制一直是研究的热点。研究认为，肺动脉内皮损伤继发的内皮细胞功能障碍在肺动脉高压的发生机制中有重要的意义。活性氧(ROS)分子对血管内皮细胞有直接的损伤作用，能引起内皮细胞功能障碍，这些现象在血管内皮细胞损伤造成动脉粥样硬化的研究中被证实。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)目前被认为是血管内皮中ROS产生的主要来源［2］，他所产生的ROS与吞噬细胞中所产生的不同，主要作为第二信使参与细胞增殖、分化、凋亡的调节，而不参与机体的细胞防御反应。

有研究证明，NOX4与慢性缺氧性肺动脉高压及新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)的发生有关。Mittal等［3］对NADPH氧化酶的各亚单位在慢性缺氧小鼠肺组织中表达的情况进行研究，发现NOX4在小鼠的肺部表达最为明显，可能参与慢性缺氧导致的肺动脉内皮损伤及肺血管平滑肌细胞的增生及慢性缺氧性肺动脉高压的形成。学者们在慢性缺氧导致肺动脉高压的其他动物模型中，也发现NADPH氧化酶所产生的活性氧能直接导致肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移，造成肺血管重构［4～7］。另外，Brennan 等［8］通过胎羊对新生儿持续性肺动脉高压的机制进行研究，干预因素引起模型动物体内ET-1浓度升高，刺激内皮细胞NADPH氧化酶的活化，造成超氧化物过量生成，导致氧化应激，引起肺动脉平滑肌层增厚、非肌性小血管的肌化等肺动脉高压的表现。

继发于左向右分流的肺动脉高压与慢性缺氧性肺动脉高压病因有所不同，那么NOX4是否也参与了分流性肺动脉高压的发生?Hwang等［9］进行动物体外实验发现，血管内异常的液体层流剪切力可上调血管内皮细胞NOX4 mRNA的表达，增加O2－等活性氧的产生，而稳定的层流剪切力则出现相反的情况。此发现说明，作为左向右分流型肺动脉高压的明确病因，异常增强的血流剪切力也可以导致血管内皮细胞NOX4表达增强，活性氧的产生增加。本实验的结果提示，随着分流时间的延长，大鼠在出现肺动脉平均压升高、右室肥厚等肺动脉高压改变的同时，肺组织中NOX4的表达也在逐步升高，NOX4 mRNA的表达水平由分流4周组的 0.27±0.08上升到分流 11周组的0.62±0.07，分流11周组的NOX4 mRNA水平与其他各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。结合已有的研究结论，可以推测，左向右大量分流产生的异常血流剪切力作为始动因素，造成肺动脉内皮损伤，引发内皮细胞NOX4表达上调，进而大量产生活性氧，通过活性氧的第二信使作用，引发肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移，造成肺血管重构及肺动脉高压。

本研究结果说明，NOX4同样参与了高肺血流性肺动脉高压形成过程，但分流型肺动脉高压的发病机制复杂，可能还涉及到其他相关的信号途径，本文仅是从NOX4的角度进行了初步探讨，其具体的分子信号转导机制需要进一步研究阐明。

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