热蒸汽—双氧水法制备人类G显带染色体的研究①

黄正思,陆洁萍,韦玉琛,冯治

(1.右江民族医学院2008级医学检验本科1班,广西 百色 533000 E-mail:si110520@163.com;2.右江民族医学院医学遗传学教研室,广西 百色 533000)

染色体显带技术,目前已广泛应用于染色体病及癌症方面的研究,是人类遗传学研究和临床细胞遗传学诊断的重要手段,能否在短时间内获取分散良好、显带清晰的染色体是加快染色体疾病诊断的关键。目前常规[1]的染色体G显带技术,常采用冰片滴片,新制的染色体标本需经自然老化或高温烘干后才能行G显带处理。常规法制备的染色体G显带标本质量常与操作者的经验有关,若经验不足,则有时造成染色体分散不良,不利于观察,给临床染色体病的检查带来困难,且烘干时间较长,在临床检测中也给来诊人员造成不便。针对上述情况,我们拟采用热蒸汽—双氧水法[2]制备染色体G显带标本,此法可改善染色体的分散度,缩短老化时间,且显带良好,易于掌握,重复性好,有效解决了以上问题。现报道如下:

1 资料和方法

1.1 试剂 RPMI640(Gibco公司),植物细胞凝集素(PHA上海伊华公司),胎牛血清(中国医学科学院血液病研究所),秋水仙素(美国 Sigma公司)和Giemsa原液,0.025%胰蛋白酶液(Sigma进口分装),甲醇、冰乙酸0.075mol/L KCl及常规细胞培养及制片耗材等。

1.2 制备方法 取25例正常人静脉血0.5ml进行细胞培养,每例做2份,1份为对照组,1份为实验组,按下列步骤进行:

1.2.1 细胞收获和低渗 对照组和实验组,均按常规培养72h后,将细胞培养物移入5ml离心管,以转速1500r/min离心8min,收集细胞。加入预温的0.075mol/L KCl溶液4ml,37℃水浴低渗22min。

1.2.2 固定 在离心前加入3∶1甲醇冰醋酸固定液1ml进行预固定,以转速 1500r/min离心 8min,去上清液加入3∶1甲醇冰醋酸固定液5ml,混匀立即离心,重复固定2次。最后一次离心后,留取0.3～0.5ml固定液,混匀。

1.2.3 滴片和老化

1.2.3.1 对照组 用冰片滴片,滴片时吸管距离载玻片25cm左右,在75℃下烘干 2～3h或自然老化2～3天。

1.2.3.2 试验组 将细胞悬液滴至热玻片上(事先将载玻片平置于水浴锅沸水的热蒸气上,吸管距离载玻片3～4cm),滴片后立即用30%过氧化氢老化10min,自来水彻底冲洗。

1.2.4 显带染色 两组用0.025%的胰酶消化显带,Giemsa染色8min。

1.2.5 观察指标 镜检,每份标本分别计数40个分裂相,试验组和对照组分别总记1000个分裂相,记录两组染色体分散优良和差两种情况所占的个数。染色体分散程度[3]:将早、中期染色体交叉数多少分为2级,即交叉数≤3为优良,交叉数≥4为差。观察两种方法的染色体显带情况。

1.2.6 统计学分析 所有资料经四方表格卡方检验。

2 结果

2.1 两种方法的镜下所见 镜下可见用常规法制片所获的染色体标本分散不良(见图1),而用改良方法[4]制备的外周血染色体标本,细胞中分散及显带良好,长度适中,标本背景清晰(见图2),标本显带质量优于或相当于常规法。

图1 常规法:染色体分散不良

图2 热蒸汽—双氧水法染色体分散及显带良好

2.2 染色体分散程度的比较 将早、中期染色体按交叉数多少分成分散优良、分散不良两级,统计学卡方检验显示,热蒸汽—过氧化氢法与常规法相比,对染色体分散差异具有高度显著性(P＜0.01),试验组 1000个分裂相有672个分散优良,占67.20%,对照组1000个分裂相有584个分散优良,占 58.40%。因此热蒸汽—过氧化氢法的染色体分散优于常规法。见表1。

表1 两种方法对染色体分散成度的影响

3 讨论

3.1 染色体分散程度是获得高质量G显带染色体标本的关键。以往采取冰片滴片,虽可使细胞较好黏附在玻片上,但滴片的高度不好掌控,高位滴片容易使细胞溅失,可能造成制片中可供分析用的染色体很少。滴片时,若操作不好,使所滴细胞悬液重叠,会造成细胞分裂重叠相而影响染色体分散效果。实验组改用热滴片法则能改善上述情况,即明显改进了染色体的分散铺展程度,降低重叠率,而且细胞染色体不易丢失,分裂相形态完整,更便于染色体显带观察。

3.2 常规法滴片后,新鲜的染色体标本需经自然老化三天或75℃高温2～3h烘干老化,使蛋白质变性,才能进行G显带处理染色体标本。本实验用30%过氧化氢对新鲜的染色体标本老化处理10min后,可立即进行染色体G显带制备,显带效果与常规法相当,甚至有部分染色体带纹优于常规法。过氧化氢是一种每个水分子里含两个氧原子的液体,具有较强的渗透性和氧化作用,可以使蛋白质变性,因此用30%的高浓度的过氧化氢可大大缩短细胞老化时间。

3.3 本实验采用过氧化氢溶液来老化处理标本后立即用胰蛋白酶消化显带,不仅带型清晰,染色体G显带成功率达100%。此法缩短了实验时间,能及时满足临床诊断需求,为患者提供方便,且不需昂贵试剂,操作简单,易于把握,重复性好,适于临床检测,可推广,进而促进染色体显带技术的发展。另一方面,此改进的滴片高度、细胞过氧化氢老化方法,学生易于把握,重复性好,可应用于教学。

[1]黄修海,单长民.医学遗传学实验指导[M].北京:科学出版社,2008:27-33.

[2]冯治,黄元河.外周血高分辨染色体制备方法研究[J].临床和实验医学杂志,2011,10(15):1139-1141.

[3]肖桂芝,冯立新,王彩凤.用低温诱导法制备人高分辨染色体[J].生物学杂志,2000(12):17.

[4]冯治.改良的外周血染色体制备技术[J].临床检验杂志,2010,28(4):319.