人源性脐带间充质干细胞移植治疗骨关节炎的实验研究*

2012-07-21 06:52陕西省人民医院骨二科西安710068
陕西医学杂志 2012年10期
关键词:光镜电镜充质

陕西省人民医院骨二科(西安710068)

易 智 刘时璋▲ 史 军△ 凌 鸣 孙正明 黄向辉 强 辉 聂治军 时 亮 史纪元

骨性关节炎(OA)是由于关节软骨发生病变、损毁及骨质增生而导致的慢性关节病。常规的治疗方法难以完全治愈,此病因软骨细胞不能随意迁移,难以快速的向损伤的位置迁移积聚,软骨破坏后自然修复的软骨组织为纤维软骨而非透明软骨,缺乏正常透明软骨的耐用性及特有力学功能[1]。为探讨人源性脐带间充质干细胞(HUCMSCs)关节腔注射治疗OA的价值,我们以新西兰大白兔建立骨关节炎模型,观察膝关节腔注射HUCMSCs后关节液中IL-1的浓度、软骨Mankin’s评分、滑膜组织的光镜和电镜改变,现报道如下。

材料与方法

1 材 料 45只大耳白兔,雄性,体重2.0~2.5kg。按Vand man方法[2]建立OA模型。随机分成OA组、干细胞治疗组和生理盐水注射对照组,每组15只。

2 方 法 在实验设计指导下对各组进行治疗处理。OA组及时处死以备用;干细胞治疗组注射1×105HUMSCs于关节腔内,每周注射1次,连续注射4周;对照组采用生理盐水注射,方法与实验组相同,最后一次注射1周后将全部动物处死。收集试验动物关节液,用ELISA双抗夹心法标记所收集关节液中的IL-1β,酶标仪450n m处读取有色反应的OD值,绘制计算曲线后计算IL-1β浓度值。将动物模型滑膜和股骨髁部软骨部分取出作为光镜观察标本;滑膜使用4%甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋,切片,HE染色后于电镜下观察滑膜形态学变化;软骨标本采用4%多聚甲醛固定,经15%乙二胺四乙酸脱钙处理10周,包埋后HE染色,光镜下观察软骨形态学变化。对切片进行Mankin’s评分;将所获得的滑膜立刻置入0.25%戊二醛中做电镜标本,1%锇酸固定2h,梯度乙醇及丙西酮脱水,618环氧树脂包埋,超薄片机切成60n m厚薄片,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,透射电镜下观察。

3 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件,统计数据以均数±标准差表示,采用T检验对3组IL-1β浓度平均值、光镜下滑膜及软骨 Mankin’s评分进行差异显著性检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 3组关节液中IL-1β浓度比较 干细胞治疗组健侧(16.37±0.44pg/ml)与 OA 组健侧(14.35±0.68pg/ml)以及对照组健侧(15.10±0.36pg/ml)比较,差异不显著(P>0.367);干细胞治疗组患侧(24.33±2.20pg/ml)与 OA 组患侧(20.16±1.07pg/ml)以及对照组患侧(20.70±1.02pg/ml)比较,两两差异不显著(P>0.05)。

2 光镜下滑膜及软骨Mankin’s评分 见附表。干细胞治疗组无论健侧还是患侧,其关节软骨及滑膜的Mankin’s评分均低于对照组及OA组,差异显著(P<0.05)。

附表 光镜下滑膜及软骨进行Mankin’s评分

3 滑膜和股骨髁部软骨光镜和电镜检测结果在光镜下OA组、对照组患侧可见细胞坏死,干细胞治疗组患侧镜下无明显的病变。由相应的PAS染色可以看出,干细胞治疗组患侧软骨染色较浅,OA组着色最深,呈鲜紫红色。对各组动物滑膜光镜照片比较研究可以看出,干细胞治疗组两只动物可见炎症细胞浸润,其余动物滑膜均未发现炎症细胞的浸润。(该炎症细胞可能为人源性脐带间充质干细胞)。电镜检查可以看出,对照组软骨细胞核呈卵圆形,细胞表面有细长突起,胞体及包膜较为完整,胞浆内可见许多的细胞器,细胞内有大量粗面内质网,细胞周围质地松散;OA组软骨细胞细胞内有大量空泡,外形不规则,细胞周晕消失,核膜不明显,细胞周围几乎未见其它组织结果;干细胞治疗组软骨细胞的各种细胞器丰富,细胞核形态正常,胞质丰富,染色质较均匀,细胞表面突起基本消失,细胞内有大量粗面内质网,胞浆中有空泡出现,细胞周围质地较为密实。

讨 论

骨关节炎是常见的慢性骨关节疾病的一种,多因为骨关节软骨面骨质增生所致,这种增生具有继发性和退行性变的特点。临床表现为关节不能灵活活动和持续的疼痛感,X射线下关节变窄并且会出现囊化变硬,易发生骨折,出现关节内游离物[3]。骨关节炎实非炎症,由于多出现退行性病变而称退行性关节炎,具体来说是关节软骨部分老化提前,尤其是关节部位软骨的老化。骨关节炎发生意味着关节老化发生,因此骨关节炎在中老年人群中的发病率很高。广义上讲,骨关节炎也包括无菌感染的关节炎疾病[4]。

本实验利用HUCMSCs在骨关节炎动物模型关节腔内移植来探讨骨关节炎治疗的新途径,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员之一,干细胞因为有重新分化成其它组织的能力,在器官移植及其它疾病治疗中具有非常重要的作用。间充质干细胞是发育早期中胚层和外胚层细胞,最先在骨髓中被发现,其多向分化,造血辅助,免疫调控的特点逐渐被人们发现,无论体内还是体外,间充质干细胞在诱导因素的刺激作用下,可以分化成脂肪、肌肉、骨、韧带、神经、内皮组织细胞等,因而间充质干细胞可以作为理想的种子,在干细胞移植治疗疾病的进程中起到非常重要的作用[5]。

HUCMSCs对兔关节炎模型关节液中IL-1β浓度影响不大,可能与建模均一性较差有关;从光镜水平上看,在光镜下OA组、对照组患侧可见细胞坏死,干细胞治疗组患侧镜下无明显细胞坏死。各组间有显著的差异性;同时,从 Mankin’s评分上看,干细胞治疗组无论健侧还是患侧,其关节软骨及滑膜的Mankin’s评分均低于对照组及OA组;说明HUCMSCs有助于骨关节炎动物模型损伤滑膜、软骨的修复。而从电镜检测结果可以看出,经过干细胞治疗,实验动物软骨破坏明显减轻,软骨组织受到修复。电镜下未发现细胞融合,实验动物模型软骨组织的修复机理可能与移植的间充质干细胞的旁分泌作用有关[6]。本次实验中模型制作比较成功,但其均一性不是很高,个体差异较大[7]。本实验以异种异基因人源性脐带间充质干细胞对动物骨关节炎模型进行干预,从光镜及电镜检查结果无宿主与移植物的相互排斥反应。HUCMSCs的自我更新、多向分化的潜能以及它们所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用,为其临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据,同时大大扩展了其临床适应证的选择范围,在骨关节病变的治疗领域具有广阔的前景。

[1]Butnariu-Ephrat M,Robinson D,Mendes DG,et al.Resurfacing of goat articular by chondr ocytes derived for m bonemarrow[J].Clin Orthop,1996,330:234.

[2]聂 林.骨关节炎的动物模型[J].中华实验外科杂志,1990,7(2):96-97.

[3]Bonnet CS,Walsh DA.Osteoarthritis,angiogenesis and infla mmation[J].Rheu matology,2005,44(5):7-16.

[4]Mur phy JM,Fink DJ,Hunziker EB,et al.Ste m cell t herapy in a caprine model of osteoarthritis [J].Arthritis Rheu m,2003,48:3464-3474.

[5]Wakitan S,Imoto K,Ya manoto T,et al.Hu manautologous culture expanded bone marrow mesenchy mal celltransplantation for repair of cartilage defects in osteoarthriticknees[J].Osteoarthritis Cartilage,2002,10:199-206.

[6]Lee R H,Ki m B,Choi I,et al.Characterization and expression analysis of mesenchy mal ste m cells fro m hu man bone marrow and adipose tissue[J].Cell Physiol Bioche m,2004,14(46):311-324.

[7]Ponticiello MS,Schinagl RM,Kadiyala S,et al.Gelatinbased resorbable sponge as a carrier matrix for hu-man mesenchy mal ste m cells in cartilage regeneration therapy[J].J Bio med Mater Res,2000,52(2):246-255.

猜你喜欢
光镜电镜充质
miR-490-3p调控SW1990胰腺癌细胞上皮间充质转化
间充质干细胞外泌体在口腔组织再生中的研究进展
汉皎光镜铭文释考
间充质干细胞治疗老年衰弱研究进展
三七总皂苷对A549细胞上皮-间充质转化的影响
2 使用减光镜进行慢速快门拍摄
竹斑蛾触角感器电镜扫描观察
电镜成像方式对数字散斑相关方法结果的影响
慢性鼻窦炎鼻息肉内镜鼻窦术后上颌窦口黏膜恢复过程分析
“拔伸松动手法”对兔膝骨性关节炎电镜下软骨超微结构的影响