活血化瘀通络方对5/6肾切除大鼠肾功能及肾组织p38MAPK信号转导途径的干预作用※

张长明 顾耀东 符 丹 阳贵林 何立群 邵命海

(上海中医药大学附属市中医医院肾内科，上海 200071)

活血化瘀通络方对5/6肾切除大鼠肾功能及肾组织p38MAPK信号转导途径的干预作用※

张长明 顾耀东 符 丹 阳贵林 何立群△邵命海1

(上海中医药大学附属市中医医院肾内科，上海 200071)

目的从p38MAPK信号转导途径观察5/6肾切除大鼠肾组织中P38 MAPK表达及α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)改变，以初步探讨活血化瘀通络方(抗纤灵方)延缓肾纤维化的作用机制。方法将40只SD大鼠中10只为正常组，30只行5/6肾切除，造模成功后随机分为模型组、抗纤灵组、氯沙坦组，各10只，各组干预12周后检测各组肾功能(血清尿素氮、肌酐)以及Western Blot检测肾组织CollagenⅠ、p38MAPK、α－SMA。结果干预12周后抗纤灵组、氯沙坦组较模型组肌酐、尿素氮有所下降，抗纤灵组、氯沙坦组p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ的分子表达较模型组明显减轻(P＜0.05)，抗纤灵组较氯沙坦组p38MAPK、CollagenⅠ分子表达减少(P＜0.05)。结论抗纤灵方可明显改善5/6肾切除大鼠的肾功能，可能通过抑制p38MAPK信号转导通路，减少α－SMA、CollagenⅠ的表达，减轻肾组织的损害。

p38丝裂原活化蛋白激酶类;生物合成;疾病模型，动物;肾疾病;中药疗法

肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭的共同病理过程，其发病机制迄今为止仍未得到完全阐明。通常认为是多因素综合作用的结果，涉及细胞外基质合成增多及降解减少、促纤维化细胞因子表达上调、单核巨噬细胞等炎症细胞的浸润，氧自由基生成过多、清除减少及肾间质细胞凋亡等方面，细胞信号转导参与多种病理过程［1］。中药抗纤灵组方在治疗慢性肾衰竭方面疗效显著，既往研究可以抑制肾间质纤维化，抗氧自由基，改善肾血流动力学等［2］。本研究通过对5/6肾切除大鼠肾组织中的p38MAPK分子表达及抗纤灵冲剂的干预，以期阐明活血化瘀通络中药治疗慢性肾衰竭的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SPF级雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量(180±20)g，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，实验动物许可证号:SYXK(沪)2004－0005，饲养于上海中医药大学实验动物中心，12 h光照，45%左右相对湿度的饲养笼中，自由饮食。

1.2 药物与试剂 抗纤灵药物组成:丹参15 g，制大黄15 g，桃仁12 g，当归12 g，牛膝9 g。大鼠按照成人20倍服用剂量，制作水提浓缩液，含生药2 g/mL，每次灌胃2 mL。氯沙坦(50 mg/片，杭州默沙东制药有限公司，国药准字H20100972)。

1.3 动物模型制作、分组及给药 大鼠购买后饲养1周，随机取10只为正常组，不做处理，直接分笼饲养。其余为造模组，3%戊巴比妥钠按1.8 mL/kg剂量腹腔注射麻醉。大鼠俯卧暴露左肾区。备皮后，从距左脊肋骨1.5 cm处做斜向外方切口，经后腹膜取肾，暴露肾脏，剥离肾周脂肪及包膜后，弧型切除2/3肾组织(主要切除皮质部分)约0.4 g。明胶海绵压迫止血，切面无活动性出血后，复位剩余左肾并缝合。7 d后相同方法麻醉大鼠，完全游离右侧肾蒂后结扎，行右肾完全结扎术。2次手术相当于切除肾脏约80%。将造模组大鼠按上述方法制作慢性肾衰竭动物模型。10 d后动物模型制备成功后，再随机将造模组分为模型组10只、抗纤灵组10只、氯沙坦组10只。正常组、模型组均予以0.9%氯化钠注射液2 mL/d灌胃。抗纤灵组予抗纤灵煎液2 mL/d灌胃，氯沙坦组予氯沙坦水溶液2 mL/d，每mL含抗纤灵或氯沙坦的剂量相当于30 kg体质量成人每日临床用量的10倍。

1.4 观察指标及方法 药物干预12周后全部处死，心脏取血液5 mL，分离血清后常规检测肾功能(尿素氮、肌酐)，肾脏组织:取肾皮质分为2份，一份用10%中性福尔马林固定，经脱水、包埋，切成2 μm厚石蜡片做苏木伊红(HE)染色，观察肾组织病理改变。一份肾组织于液氮中速冻后－80℃冰箱保存。

Western Blot检测方法。蛋白样品制备:先进行蛋白抽提，BCA法测蛋白浓度，在562 nm左右测光吸收度，做标准曲线，计算蛋白样品浓度，调整蛋白样品浓度至1 g/L。取30 g蛋白样品与1/4体积样品缓冲液混匀，95℃，5 min。配胶，上样(1.5 mm，10 well，37.5L)，电泳，80 V恒压30 min后，换120 V恒压。当溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部时，停止电泳。转膜:配制转膜缓冲液，4℃预冷。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸润5～10 min，用水漂洗，再放入转膜液中。转膜时电压为10 V，50 min。转膜后，将膜放置于封闭液中，TBS缓冲液(Tris缓冲盐溶液)+0.05%Tween－20即TBST;封闭液:5%牛血清白蛋白溶于TBST中，室温下摇床振荡1h。封闭后，用TBST洗膜3次，5 min/次。用抗体稀释液稀释一抗，检测所需的一抗:CollagenⅠ、α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)购自Abcam(香港)有限公司;p38MAPK购自Cell Signaling Technology公司。批号:CollagenⅠab90395;α－SMA ab7817，p38MAPK，#9212。将膜浸泡于一抗反应液中，4℃过夜。过夜后，将膜置于室温复温30 min～1 h。洗膜:室温下，用TBST漂洗膜，4次，5 min/次。孵育二抗:用TBST稀释二抗，Goat Anti－ Mouse和 Goat Anti－ Rabbit，1∶5000。室温避光孵育15 min，然后用TBST冲洗5 min，在近红外双色激光成像仪器中进行扫描，最后将得到的图片进行灰度值分析，甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。计算各组灰度值与GAPDH的比值进行分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示，采用完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)，多组之间的两两比较采用LSD－t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组12周时血清尿素氮、肌酐检测结果 见表1。

表1 各组12周时血清尿素氮、肌酐检测结果±s

表1 各组12周时血清尿素氮、肌酐检测结果±s

与模型组比较，*P ＜0.05;与抗纤灵组比较，△P ＜0.05

组 别 n 尿素氮(nmol/L) 肌酐(μmol/L)正常组10 5.630 ±0.365 30.400 ±2.757模型组 10 8.620 ±0.658 60.900 ±10.060抗纤灵组 10 7.167 ±0.686* 44.333 ±21.325*氯沙坦组 10 7.970±0.914＊△ 48.900±5.343＊△

由表1可见，12周时抗纤灵组、氯沙坦组血清尿素氮、肌酐低于模型组(P＜0.05)，而抗纤灵组降低血清尿素氮、肌酐优于氯沙坦组(P＜0.05)。

2.2 各组12周时肾皮质p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相对表达含量比较 见表2。

表2 各组12周时肾皮质p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相对表达含量比较±s

表2 各组12周时肾皮质p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相对表达含量比较±s

与模型组比较，*P ＜0.05;与抗纤灵组比较，△P ＜0.05

组 别 p38MAPK/GAPDH α－SMA/GAPDH CollagenⅠ/GAPDH正常组0.720 ±0.093 0.647 ±0.030 0.771 ±0.071模型组 1.387 ±0.061 0.951 ±0.040 1.683 ±0.171抗纤灵组 0.902 ±0.141* 0.779 ±0.063* 0.840 ±0.181*氯沙坦组 1.050 ±0.100＊△ 0.687 ±0.067* 0.996 ±0.006＊△

由表2可见，3种蛋白相对表达检测抗纤灵组、氯沙坦组与模型组相比均有所降低(P＜0.05)，p38MAPK、CollagenⅠ氯沙坦组高于抗纤灵组(P＜0.05)。α－SMA氯沙坦组与抗纤灵组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但均明显低于模型组(P＜0.05)。

3 讨论

引起慢性肾衰竭的原因有很多，本实验选择5/6肾切除模型进行研究，由于有效肾单位被大部分切除，残余肾脏通过代偿，引起肾系膜细胞、毛细血管等大量增生，肾通透性增加。健存肾单位代偿性高滤过，导致肾小球的进一步硬化，进而引起肾小管间质损伤。残余肾单位发生血流动力学改变，肾脏出现高灌注、高滤过、高跨膜压(即所谓“三高学说”)，导致残余肾代偿性肥大、增生、硬化，最终表现为进行性肾小球、肾小管功能减退，后期进展为终末期肾病。

肾间质纤维化是以细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的不断积聚和α－SMA阳性的肌纤维母细胞的不断新生、活化为特征的过程。细胞外基质中主要成分就是Ⅰ型、Ⅲ型胶原等，肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭的共同病理过程［3］。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是联系细胞膜受体与细胞内重要的酶类，在细胞信号转导方面起重要作用，它能将细胞外刺激信号转到细胞及其核内，引起细胞一系列生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)［4］。p38MAPK信号通路作为MAPK家族的主要成员，通过对细胞内信号的传递参与细胞对外界许多刺激的调节反应。通过非磷酸化转化为磷酸化状态来促进下游底物的磷酸化，快速实现信号传递。肾脏固有细胞转化成肌纤维母细胞并在肾间质中聚集、细胞外基质合成增多及降解减少、肾间质细胞凋亡等导致肾纤维化发生［5］。

中医学认为，慢性肾衰竭的病机为本虚标实，本虚以脾肾亏虚为主，标实多为湿浊、热毒、水气、动风，而瘀血贯穿于慢性肾衰竭的始终。中医的“瘀”范围广泛，病理方面表现为肾小球硬化、球囊粘连，小管间质纤维化和萎缩，肾小球内微血栓，系膜外基质增多，基底膜增厚，毛细血管腔塌陷或狭窄，血管襻挤压、闭塞等改变。

抗纤灵多年来一直用于临床和科研，方中当归、丹参、桃仁养血活血通络，制大黄活血降浊通便，牛膝补肾强腰膝，合方以活血化瘀通络为主。既往结果表明本方可能通过降低大鼠肾组织NF－κB及ATⅡ、ATⅡ受体mRNA表达，延缓肾纤维化进展，进而保护残余肾单位的功能［6］。

血管紧张素受体拮抗剂(ARB)，不仅可以降低肾性高血压，还有一定的肾脏保护作用。其作用机制独立于降压之外，可以激活或抑制一些细胞因子或信号转导途径而起到肾脏保护有关［7］。氯沙坦(losartan)为非肽类高选择性血管紧张素Ⅱ－1型受体(AT1)阻滞剂，可拮抗AngⅡ诱导足细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)增高，提示ARB类药物可以通过下调足细胞VEGF的表达水平，而减少蛋白尿的发生，发挥保护肾脏作用［8］。

本研究结果表明氯沙坦、抗纤灵均可以降低5/6肾切除大鼠血清尿素氮、肌酐，延缓肾脏功能恶化。改善肾功能抗纤灵组优于氯沙坦组，5/6肾切除术可能触发p38MAPK信号转导通路，诱导细胞内p38MAPK表达增加，进一步启动促纤维化因子—α－SMA而诱导细胞内CollagenⅠ的合成，导致了肾纤维化的发生。抗纤灵方可能是通过抑制p38MAPK信号转导通路，减少α－SMA、Ⅰ型胶原的表达，通过改善血流动力学等以减轻肾组织的损害。

［1］王海燕.肾脏病学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:799－815.

［2］吴锋，何立群，张新志，等.抗纤灵冲剂对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织氧化应激反应的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10(12):1042－1045.

［3］陈永熙，陈楠.延缓肾纤维化进展的机制［J］.肾脏病与透析移植杂志，2008，17(3):271－274.

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Intervention effect of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral on renal tissue p38MAPK signal transduction pathway in rats with 5/6 kidney resection

ZHANG Changming，GU Yaodong，FU Dan，et al.Department of Nephrology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200071

ObjectiveTo observe signaling molecules protein expression in the renal tissue and changes of a－SMA(a－smooth muscle actin)and Collagen I(type I collagen)by p38MAPK signal transduction pathway，and explore the mechanism of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral(Kangxianling prescription)for delaying renal fibrosis.Methods30 of 40 SD rats were made 5/6 kidney resection model，10 rats was as a normal group.30 rats with 5/6 kidney resection were randomly divided into model group，Kangxianling prescription group Losartan group.The levels of creatinine and urea nitrogen and molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I were measured after intervention of 12 weeks.ResultsThe levels of creatinine and urea nitrogen in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group after 12 weeks.Molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group(P＜0.05).The expression of p38 MAPK and Collagen I in Kangxianling prescription group were decreased as compared with those in Losartan group(P＜0.05).ConclusionKangxianling prescription can significantly improve renal function of rat with 5/6 kidney resection，by inhibition of p38MAPK signal transduction pathways，to reduce the expression of a－SMA，I collagen，and mitigate the damage of kidney tissue.

p38 mitogen－activated protein kinase;Biosynthesis;Disease model;Animal;Renal disease;Traditional Chinese medicine therapy

R－332;R345.57;R692.053.1;R692.5

A

1002－2619(2012)11－1704－03

※项目来源:上海市卫生局科研课题(编号:2010220);国家自然基金(编号:81173219);科技部中医药行业科研专项(编号:201007005);高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(编号:20093107110006);上海市科委创新行动计划项目(编号:11DZ1973100);上海市教育委员会E－研究院建设计划资助项目(编号:E03008);上海高校创新团队建设项目(编号:201203)

△通讯作者:上海中医药大学附属曙光医院肾内科，上海201203

1 上海中医药大学附属曙光医院肾内科，上海 201203

张长明(1970—)，男，副主任医师，博士，硕士研究生导师。从事慢性肾衰竭的中西医结合研究。

2012－07－16)