HPLC法快速检测记忆缺失性贝毒软骨藻酸

周秀锦，周向阳，郑 斌，邵宏宏，王淑娜

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316100)

贝类毒素是有毒有害赤潮生物产生的生物活性物质的总称，又被称为赤潮生物毒素。贝类毒素不仅严重破坏海洋渔业资源和水产养殖，恶化海洋环境，还可以通过食物链的传递，危害人类健康，造成人体中毒甚至死亡。在世界范围内，由赤潮毒素引起的人员中毒和死亡事件屡见不鲜。

首次报道记忆缺失性贝类毒素事件是在1987年加拿大爱德华王子岛发生因食用养殖紫贻贝而引起的食物中毒。随后加拿大国立大西洋研究中心的QUILLIAM等从当地居民食用的养殖贝类体内分离出了一种被称为软骨藻酸(Domoic Acid，DA)的活性物质，确认它为引起中毒的化学物质，并肯定该物质来源于经常在加拿大东海岸形成赤潮的一种硅藻[1]。1996年，墨西哥Baja地区，成百上千只海鸟因食用体内富集高浓度DA的螃蟹、凤尾鱼、沙丁鱼中毒死亡[2]。1998年美国加利福尼亚州中部沿海发生400多头海狮中毒死亡事件，存活的海狮中有神经功能失调症状，从海狮的体液中检测出了高浓度DA[3]。由DA引起的中毒症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，同时有昏眩、昏迷等类似神经性中毒症状，一段时间内丧失部分记忆是此类中毒的典型特征，因此这类毒素被称为记忆缺失性贝类毒素[4]。软骨藻酸是记忆缺失性贝类毒素的最常见生物毒素，是由硅藻门Bacillariophyta、羽纹硅藻纲Pennatae、管壳缝目Aulonoraphidinals、菱形藻科Nitzschiaceae中的拟菱形藻属Pseudo-nitzschia和菱形藻属Nitzschia中硅藻的某些种产生的一种兴奋性神经毒素。软骨藻酸是一种溶于水具有强烈神经毒性、与红藻酸(2－梭基－3－异丙稀基脯氨酸)相关的兴奋性非蛋白氨基酸类物质[5]。软骨藻酸是长链羽状硅藻Nitzschia pseudodelicatissima的代谢物[6]，热稳定，熔点为223～224℃。易溶于水、稀酸和碱溶液中，微溶于甲醇和乙醇，不溶于石油醚和苯，紫外光谱最大吸收波长为242 nm。水中的贝类和鱼类对DA有较强的耐受力，它们可以富集藻类产生的DA，再经食物链的传递对所在地区的生态环境造成影响，人类食用被DA污染的海产品后即可引起中毒。1998年被英国作为贝类动物的常规检测项目，规定DA＜20 mg/kg的贝类才可以食用。

笔者根据软骨藻酸贝类毒素的性质，建立一种快速简便的高效液相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 方法原理

试样中的记忆缺失性贝类毒素经适当甲醇水提取，经过阴离子柱净化，用高效液相色谱仪进行检测；外标法定量。

1.2 试剂和材料

实验所用试剂应无干扰峰，除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682一级水的要求。

1.2.1 试剂

甲醇、乙腈，色谱纯；三氟乙酸，优级纯；冰乙酸，盐酸，氢氧化钠，氨水，甲酸铵，乙酸铵，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸铵，磷酸氢二铵，庚烷磺酸钠。标准品：软骨藻酸(DA)购自加拿大海洋局，Lot＃20071205。

1.2.2 仪器

高效液相色谱仪：配紫外－可见光检测器(岛津LC－20A)；电子天平(梅特乐公司CP124S)：感量0.000 1 g；离心机(西格玛公司 3－18K)：10 000 r/min；微孔滤膜：0.45 μm；组织均质器(IKA 公司 T25BASIC)；旋转蒸发仪(LABOROTA－4003)；旋涡混合器(IKA 公司 MSI)。

1.3 样品处理

取样：用清水清洗外壳，开壳，清水淋洗除去泥沙等外来杂质，取可食用部分用作检测，匀质。

提取：称取试样5.0 g，于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇水溶液，旋涡混匀，超声波提取5 min，以4 000 r/min离心5 min，移取全部上清夜至50 mL离心管中。

柱净化：取阴离子交换柱，依次用6 mL甲醇，3 mL水，3 mL 50%甲醇水溶液过柱活化，然后取提取液5.0 mL，以1滴/s的速度过柱，再用1 mL甲醇洗涤，弃去流出液，挤干，最后用2 mL冰乙酸+甲醇(25+75)洗脱，收集洗脱液。45℃水浴，N2吹干。准确移取1 mL乙腈+水(1+9)溶解残留物，转移到5 mL离心管，加入1 mL正己烷萃取，静置1 min，弃上层液体，下层过0.45 μm微孔滤膜，供高效液相色谱仪检测。

1.4 色谱条件

色谱柱：Venusil ASB C8，4.6×250 mm；流动相：乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸钠；流速：1.0 mL/min；检测条件：紫外检测器，检测波长242 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

1.5 标准工作曲线

以乙腈+水(1+9)稀释标准储备液分别配成为含软骨藻酸 0.1、1.0、2.5、10.0、25.0 μg/mL 的标准溶液，按样品处理柱净化步骤进行，高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。测量保留时间和峰面积，用峰面积和含量作图，绘制标准曲线。

1.6 计算

样品中软骨藻酸的残留量按下式计算。

X/mg·kg-1为样品中软骨藻酸的残留量；Ci/μg·mL-1为标准曲线上查出试样溶液中软骨藻酸的浓度；V1/mL提取液总体积；V2/mL为净化用提取液体积；V3/mL为洗脱液体积；m/g为样品重量。

2 结果与讨论

2.1 提取时间的选择

设计超声波提取时间分别为2、3、5、7、10 min，经检测发现提取5 min时，提取接近完全，延长提取时间意义不大，故选取提取时间为5 min。

2.2 离子交换柱类型以及过柱条件的选择

(1)柱子类型：分别自行生产的I、II、III型阴离子交换柱，取适量提取液过柱净化洗涤后，用2 mL冰乙酸甲醇溶液洗脱；处理洗脱液后上高效液相色谱检测，以检验离子交换柱的净化效率，结果见表1，I型阴离子交换柱净化效果最佳。

表1 DA在不同离子交换柱的净化效果Tab.1 DA is purified by different anion exchange cartridges

(2)柱pH：用氨水调节提取液pH为7、9、11、14，过柱后收集洗脱液上机检测；结果表明：随着pH的升高，柱子上保留的杂质量也相应升高，严重影响检测。

(3)过柱体积：设定过柱的提取液体积分别为3、5、8、10、15 mL，过柱后收集洗脱液上机检测；试验发现：过柱提取液的体积过高或过低，都影响柱子的保留效率，体积过低及过高还会导致部分杂质保留在柱体上，影响检测结果。

(4)洗脱液的体积：试验表明，2 mL洗脱液基本能将柱子上吸附的目标物质完全洗脱下来，增加洗脱液的体积意义不大。

2.3 色谱条件的优化

配制了乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸钠、0.1%三氟乙酸+乙腈+甲醇和0.1%三氟乙酸+乙腈+0.5%庚烷磺酸钠溶液三种流动相，后2种峰形和分离度较差，因此采用乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸钠作为实验的流动相。

2.4 方法的精密度、线性关系

图1 软骨藻酸标品、空白样品、加标样品的高效液相色谱图，保留时间17.732 minFig.1 Chromatogram of DA standard,blank sample,spiked ample by HPLC,RT=17.732 min

配成浓度为0.1、1.0、2.5、10.0、25.0 μg/mL 的软骨藻酸标准溶液系列，进样20 μL，软骨藻酸的保留时间约为17.732 min，测量峰面积，计算平均值，求得回归方程Y=0.010 975 x+0.009 456，r=0.999 9，相对标准偏差分别为6.3%、4.8%、5.7%、3.9%、5.9%，平均为5.3%。

2.5 样品测定回收率试验

称取两批贝肉，在其中加入不同浓度的软骨藻酸标准品。各称取5.0 g，按照1.3样品处理中步骤进行，高效液相色谱仪检测定量。检测4组不同添加浓度的贝肉，计算测定方法回收率、精密度和检测下限，结果见表2。DA标准溶液、空白样品、空白样品添加色谱图如图1所示。

表2 样品中添加回收率及方法的精密度试验(n=5)Tab.2 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=5)

3 结论

综上所述，为检测贝类产品中的记忆缺失性贝类毒素软骨藻酸，采用甲醇水溶液进行提取，经过阴离子交换柱净化，正己烷萃取等处理，使用高效液相色谱仪进行检测。前处理时间短，处理后的样品中杂质少，该方法可达到下限200 μg/kg，准确度和精密度等性能指标符合相关要求，适用于贝类食品的检测。

[1]BERMAN F W,MURRAY T F.Domoicacidneurotoxicity in cultured cerebellar ganule neuronsis med-iated predominately by NMDA reactivated as a consequence of excitatoryreceptors that a amino acid rele-ase[J].Journal of Neurochemistry,1997,69:693-703.

[2]虞秋波,高亚辉.拟菱形藻软骨藻酸研究进展[J].海洋科学,2003,27(8):26-29.

[3]SCHOLIN C A,GULLAND F,DOUCETTE G J,et al.Mortality of sea lions along the central calif-arnia coast linked to a toxic diatom bloom[J].Nature,2000,403:80-84.

[4]XI D,RAMSDELL J S.Glutamate receptors and calcium entry mechanisms for domoic acid in hippo-campal neurons[J].Neuroreport,1996,7:1 115-1 120.

[5]BERMAN F W,MURRAY T F.Domoicacidneurotoxicity in cultured cerebellar granule neuronsis media-ted predominately by NMDA receptors that a reactivated as a consequence of excita-tory amino acid rele-ase[J].Journal of Veurochemistry,1997,69:693-703.

[6]BERMAN F W,LEPAGE K T,MURRAY T F.Domoic acid neurotoxicity in cultured cerebellar granule neurons is 21 controlled preferentially by the NMDA receptor Cainflux pathway[J].Brain Research,2002,924:20-29.