再治疗根管粪肠球菌生物膜形成与临床表现相关性分析

郑建博 王丽娜 宋其义 李继遥 牛卫东

（1.大连医科大学口腔医学院 口腔内科教研室，大连 116044；2.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；3.四川大学华西口腔医院 牙体牙髓病科，成都 610041）

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是根管治疗失败患牙内最常见的细菌之一，被认为是导致根管治疗失败的一个重要因素[1]。在根管充填完善但仍有持续根尖损害的根管中，粪肠球菌的感染率为24%～77%[2]。该菌不仅可以单独引起根管内感染，而且可以与其他细菌混合引起根管内感染。粪肠球菌对常用的根管灭菌药物及抗菌药物有极强的抵抗力，临床医师往往很难用传统的治疗方法将定植于根管中的粪肠球菌彻底清除。

细菌生物膜是由多个细菌不可逆地黏附于机体或物体表面而形成，细菌被自身细胞分泌的基质所包被，能表达一套和浮游状态下不同的基因。生物膜结构有助抵御外界因素如抗菌剂的影响，对细菌有保护作用并使细菌具有更强的致病性[3]。研究[4]表明：人类的细菌感染与生物膜有关，生物膜具有极高的耐药性和免疫逃逸能力，这一特性是许多细菌感染难以根除的重要原因之一。生物膜状态下的粪肠球菌具有更强的存活力和致病性。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

96孔、12孔平底组织培养板（Corning公司，美国），BA琼脂培养基，胰蛋白胨大豆肉汤培养基（trypticase soy base，TSB），甲醇，无水乙醇，纯甘油。MEISHENG型高频牙科X线机（上海西域科技有限公司），Multiskan MK3型全自动酶标仪（北京平利洋医疗设备有限公司），JSM-6360LV型扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（日本电子株式会社）。

1.2 实验菌株

2008年10月—2009年5月于四川大学华西口腔医院门诊收集根管治疗失败、需要根管再治疗患者根管内的细菌，共收集53例粪肠球菌临床株，-20℃保存于50%的甘油中[5-7]。

1.3 病史的采集[8]

详细记录每位患者的基本信息（包括姓名、性别、年龄、牙位、初诊时间、初诊原因），每颗患牙的症状和体征（包括是否存在自发痛、咬合痛、叩痛，是否有牙龈脓肿和瘘道），以及X线检查情况（包括根尖阴影的直径和原根管充填情况，是超填、欠填还是恰填）。

1.4 粪肠球菌生物膜形成的检测[9]

粪肠球菌在BA琼脂培养基上复苏、传代、分离纯化后，取一个单菌落接种至TSB中。将在TSB中培养18～24 h的粪肠球菌调整至0.5麦氏标准浊度，用含有0.25%葡萄糖的新鲜TSB按1∶100稀释，取200μL接种在96孔无菌平底组织培养板中，35℃静置培养24h。用PBS（pH=7.2）缓冲液洗板3次除去浮游粪肠球菌，倒置干燥后用甲醇固定15min，1%结晶紫染色15min，水洗至无色，以无水乙醇溶解结晶紫，在570 nm波长处读取各孔光密度（optical density，OD）值。以TBS作为空白对照，每个菌株做3个复孔，同一实验重复3次并计算出OD570nm的平均值。根据测定结果，菌株生物膜形成能力分为4类[10]：OD570nm≤1为阴性（-），即无生物膜形成；1＜OD570nm≤2为弱阳性（+）；2＜OD570nm≤3为中等阳性（++）；OD570nm＞3为强阳性（+++）。

1.5 生物膜的SEM观察

选择粪肠球菌生物膜形成能力阳性和阴性的菌株各1株，在12孔板上建立粪肠球菌生物膜模型。将粪肠球菌接种在TSB中配制成0.5麦氏标准浊度的菌悬液，37℃过夜培养。用含有0.25%葡萄糖的新鲜TSB按1∶100稀释，取2mL接种于已放入聚氯乙烯圆片的12孔平底组织培养板中，35℃静置培养24 h后用PBS去除表面的浮游菌，用2.5%戊二醛溶液固定。95%乙醇与叔丁醇联合梯度脱水后，将聚氯乙烯圆片装入样品盒中置于CO2临界点干燥仪中干燥2 h。喷金5min后，进行SEM观察。

1.6 统计学分析

用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用χ2检验进行比较，分析生物膜形成能力与临床症状之间的关系，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 粪肠球菌形成生物膜的能力

对53株粪肠球菌的临床分离株进行生物膜形成能力检测，其结果见表1。以OD570nm＞1为生物膜形成阳性，53株中阳性菌株有40株（75.47%），阴性菌株有13株（24.53%）。

表1 临床分离粪肠球菌的生物膜形成能力Tab 1 Biofilm formation of Enterococcus faecalis from clinical isolated

2.2 生物膜的SEM观察

图1为形成能力不同的粪肠球菌培养24 h后生物膜的形成情况。生物膜形成能力阳性的菌株可见细菌密集生长，多个微菌落互相融合且聚集在一起形成膜状集落，生物膜表面形成很多空隙，并有一定的厚度；形成能力阴性的菌株细菌多散在分布，数量明显少于生物膜形成能力阳性的菌株，微菌落不能互相融合形成膜状结构。

2.3 生物膜形成能力与临床表现的相关性分析

患牙的临床症状与粪肠球菌生物膜形成能力的相关分析见表2。对表2进行统计学分析，四格表χ2检验结果显示：瘘道与再治疗根管粪肠球菌生物膜形成有相关性，其结果具有统计学意义（P＜0.05）；自发痛、咬合痛、叩痛、牙龈脓肿、根尖暗影等其他临床表现与再治疗根管粪肠球菌生物膜形成的相关性无统计学意义（P＞0.05）。在再治疗根管中，无瘘道的患牙分离出来的粪肠球菌生物膜形成能力强于有瘘道的患牙。

表2 粪肠球菌生物膜形成能力与临床表现的相关性分析Tab 2 Correlation analysis for Enterococcus faecalis biofilm formation ability and clinicalmanifestation

3 讨论

粪肠球菌呈圆形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，大多数成对或短链状排列，通常情况下不运动。该菌对营养要求低，在普通培养基上也可以生长，能在10℃或45℃、pH=9.6或含6.5%NaCl的肉汤培养基中生长，并能耐受65℃ 30min。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖；可水解七叶苷，与柠檬酸铁铵中的铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素。

许多人类的细菌感染与生物膜有关，生物膜具有极高的耐药性和免疫逃逸能力，生物膜内细菌较其浮游状态时对抗生素的耐药性高100～1000倍[11]，这一特性是许多细菌感染难以根除的重要原因之一。

根管内的粪肠球菌主要以生物膜形式存在。已有实验[12-13]证实：粪肠球菌的耐药性与该菌生物膜形成存在相关性。有关生物膜的研究技术主要包括以下几点。1）生物膜发生装置。它是研究生物膜的首要工具，主要有以下4种：①试管法培养生物膜，简便、灵活、较常用；②微孔板法，常用96孔板或384孔板，具有批处理优势，常应用于考察药物对生物膜的作用；③置片法，生物膜静态培养于玻璃、硅胶或金属等管状或片状物上，具有直观及可移动处理的特点；④管路法、流室法等，均属于动态造膜法，更能模拟生物膜的形成。2）生物膜检测技术。主要有：①染色法，常用结晶紫或沙黄等染料对生物膜中的成分染色后，用分光光度计或酶标仪定量测定，适用于试管法或96孔微板法；②菌体计数，计数生物膜中的菌体进行量化测定；③荧光法，用不同颜色的荧光染料区分生物膜内的死菌与活菌；④显微镜技术。本实验参考以上各种方法的优缺点，同时参考了许多相似的文献，采用96孔板建立粪肠球菌生物膜的体外模型，结合结晶紫染色和酶标仪读数，对临床分离的粪肠球菌生物膜形成能力进行半定量分析，同时采用SEM对生物膜形成能力为阳性和阴性的细菌进行确认，结果表明：绝大多数（75.47%）临床分离的粪肠球菌有一定的形成生物膜的能力，其中有7株生物膜形成能力较强。此方法可以对细菌生物膜形成能力进行可靠分析，即可定性又可定量，方法准确、高效、简便，可用于临床菌株生物膜形成能力的分析，也可为下一步研究细菌生物膜的耐药机制奠定基础。

本实验针对不同的临床表现与粪肠球菌生物膜形成能力进行统计分析，结果显示：瘘道与再治疗根管粪肠球菌生物膜形成有相关性，其结果具有统计学意义（P＜0.05），自发痛、咬合痛、叩痛、牙龈脓肿、根尖暗影等其他临床表现与再治疗根管粪肠球菌生物膜形成的相关性无统计学意义（P＞0.05）。在再治疗根管中，无瘘道的患牙分离出来的粪肠球菌形成生物膜的能力要强于有瘘道的患牙分离出来的粪肠球菌形成生物膜的能力。该结果提示：对于再治疗的根管，在有粪肠球菌检出的情况下，无瘘道的患牙应给予足够的重视，由于其生物膜形成能力较强，应采取更加有针对性的冲洗液和抗生素，抑制和瓦解粪肠球菌的生物膜，防止根管治疗再次失败。

一旦生物膜形成，抗生素就难以渗透进入杀死细菌，造成感染迁延不愈，预后较差。目前主要通过抑制细菌生物膜的形成和通过杀菌剂作用于已形成稳态的生物膜两方面来进行防治。但是，细菌生物膜相关感染的防治仍是临床上一个亟待解决的难题，因为目前应用的抗菌药物并不能完全清除细菌生物膜。目前除了应用抗生素治疗细菌生物膜导致的相关感染外，还发现了许多其他可能有效的方法，但尚不成熟，有待于进行更加深入的探索。

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