丽格海棠‘宣言’离体再生因素的优化

王海朋，羿德磊，段祖安，崔为正，王洪利

(山东农业大学林学院;农业生态与环境重点实验室，山东泰安 271018)

丽格海棠(Rieger begoni)为秋海棠科秋海棠属多年生草本盆栽花卉，冬季开花、花色丰富、花期长，是目前国内流行的年宵花卉，也是国际花卉市场上的畅销盆花之一［1，2］。其种子繁殖易变异，扦插繁殖浪费大量材料且移栽成活率较低［3］，生产栽培受到限制。李进进等［1－12］对丽格海棠组培技术做了探索和研究，取得了一些进展，但各研究结果间存在较大差异，可重复性低，难以直接应用与工厂化生产。本文旨在通过对影响丽格海棠‘宣言’叶片再生因子的研究，找到其分化繁育的最佳培养基，用于推动该优良品种种苗的繁育及其产业化进程，以便为丽格海棠其他优良品种的研究、生产提供一般参照。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

材料来自于山东农业大学林学实验站。清水冲洗10 min，升汞消毒后用无菌水冲洗2～3遍为外植体。

1.2 方法

1.2.1 不同外植体对丽格海棠不定芽诱导的影响 取丽格海棠叶片、叶柄、花托，接种到MS+6－BA 2.0 mg· L－1+NAA 0.2 mg· L－1+蔗糖30 g· L－1中，培养30 d后统计不定芽诱导数和不定芽诱导率，确定适宜的外植体。试验中每个处理接种10瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复(下同)。

1.2.2 不同培养基对丽格海棠不定芽诱导的影响 将外植体分别接种到不同类型培养中(MS、B5、N6)中，附加6 －BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1，培养30 d后统计不定芽诱导数和不定芽诱导率，确定适宜的培养基。

1.2.3 不同细胞分裂素对丽格海棠不定芽诱导的影响 细胞分裂素对不定芽诱导有重要的作用，本试验以6 － BA 、KT、ZT(1.5、2.0 、2.5 mg· L－1)为影响因子，设计3 水平4 因素的正交试验 L9(34)(见表 3)，分析不同细胞分裂素对丽格海棠不定芽诱导的影响，培养30 d后统计不定芽诱导状况。

1.2.4 激素配比对丽格海棠不定芽增殖的影响 影响丽格海棠不定芽增殖的主要因素是激素配比，以6－ BA(1.0、1.5、2.0 mg· L－1)、NAA(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)、IAA(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)为影响因子，设计3水平4因素正交试验L9(34)，分析不同激素配比对丽格海棠不定芽增殖的影响(见表4)。取诱导生长到2 cm左右的丽格海棠不定芽进行接种，培养30 d后统计增殖状况。

1.2.5 培养基成分对丽格海棠不定芽增殖的影响 培养基成分影响丽格海棠不定芽增殖状况，以微量元素(1/4MS、1/2MS、MS)、大量元素(1/4MS、1/2MS、MS)、碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖30 g· L－1)，设计3 水平4 因素正交试验L9(34)(见表5)，分析不同成分组合对丽格海棠不定芽增殖的影响，培养30 d后统计增殖状况。

1.2.6 不同生长素对丽格海棠无根苗的生根壮苗的影响 切取生长高度为3 cm左右的丽格海棠无根苗，接入附加不同浓度(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)IAA、NAA 、IBA 的 1/2MS 中，培养 30 d 后统计分析生根状况，确定生根培养基。

1.2.7 培养条件 培养基附加琼脂 6.5 g· L－1和糖，pH 为5.8，培养温度25℃，光照时间12 h，光照强度2000 Lx。

1.2.8 数据处理和统计方法 诱导率=诱出不定芽外植体数/接种外植体总数×100%;诱出不定芽平均数=诱出不定芽总数/接种外植体总数×100%;增殖倍数=诱出无根苗总数/接种无根苗总数;苗分化率=分化幼苗数/接种幼苗苗总数×100%;数据统计与分析采用SAS 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对丽格海棠不定芽诱导的影响

把不同部位的外植体接入到培养基中，观察其分化状况，叶片膨大、出现不定芽时间分别为7 d、14 d，叶柄、花托平均为14 d、20 d。

表1 不同外植体对丽格海棠不定芽诱导的影响Table 1 Effects of different explant on induction of buds

由表1可知，叶片不定芽诱导率最高，为96.7%。因此，叶片是丽格海棠不定芽诱导的最佳外植体。

2.2 不同培养基对丽格海棠不定芽诱导的影响

观察接种于培养基MS、B5、N6中叶片不定芽诱导状况可知，诱出不定芽平均数分别为20.4、17.5、15.9，其分化率在MS培养基中最高，为96.7%(见表2)。因此，MS是丽格海棠不定芽诱导的最佳基本培养基。

表2 不同培养基对丽格海棠不定芽诱导的影响Table 2 Effects of different basic culture on induction of buds

2.3 不同细胞分裂素对丽格海棠不定芽诱导的影响

对统计的丽格海棠不定芽诱导率进行方差分析，由表3可知:6－BA对诱导丽格海棠叶片不定芽诱导率有显著影响，KT、ZT对诱导丽格海棠叶片不定芽率没有达到显著水平。

表3 不同细胞分裂素对丽格海棠不定芽诱导的影响Table 3 Effects of different cytokinins on induction of buds

因此，6－BA(2.0 mg·L－1)是丽格海棠叶片不定芽诱导的最佳细胞分裂素。

2.4 激素配比对丽格海棠不定芽增殖的影响

通过对丽格海棠苗分化率进行方差分析，由表4可知:6－BA、NAA对丽格海棠叶片不定芽增殖有显著影响，IAA对诱导丽格海棠叶片不定芽增殖没有达到显著水平。

表4 激素配比对丽格海棠不定芽诱导的影响Table 4 Effects of hormone ratio on induction of buds

因此，6－ BA 1.5 mg·L－1+NAA 0.1 mg·L－1是丽格海棠叶片不定芽增殖的最佳激素配比。

2.5 培养基成分对丽格海棠不定芽增殖的影响

以丽格海棠苗分化率来作为统计数据，进行方差分析，结果见表5:

表5 培养基成分对丽格海棠不定芽增殖的影响Table 5 Effects of construction of culture on the growth and polarization status

微量、碳源对丽格海棠叶片不定芽增殖分别达到极显著和显著水平，大量元素对丽格海棠叶片不定芽增殖影响不显著。邓肯氏检验计算表明，1/2MS(微量)、MS、蔗糖(30 g·L－1)是最佳组合。

2.6 不同生长素对丽格海棠无根苗的生根壮苗的影响

丽格海棠在1/2MS附加IAA、NAA、IBA的生根培养基中生长30 d时生根情况见表6:

表6 不同种类的生长素对丽格海棠生根的影响Table 6 Different types of concentration of auxin to rooting

由表6可以知:丽格海棠在1/2MS+IAA 0.1mg·L－1的生根培养基中生根率最高，可达93.3%，且苗高最高;3种生长素都可诱导较高的生根率，IAA对根的诱导、根的伸长优于其他两种生长素;提高生长素有利于增加生根数，但生根较细。

3 结论

影响丽格海棠不定芽诱导的因素是外植体、培养基和分裂素种类，诱导不定芽培养基为MS+6－BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1;增殖的主要因素是微量的多少、碳源及激素配比，不定芽增殖培养基为MS+1/2MS(Trace element)+Sugar 30 g·L－1+6 － BA 1.5 mg·L－1+NAA 0.1 mg·L－1。本试验研究确定的丽格海棠不定芽诱导培养基与不定芽增殖分化培养基与李进进、魏占才等［3－12］所报道的有一定差异，可能是丽格海棠的基因型差异和外植体不同部位等原因所致。

生根培养基为1/2MS+IAA 0.1 mg·L－1，适宜生长素种类有更明显的促进生根壮苗效果。诱导不定根宜降低MS培养基离子浓度，这在许多植物组织培养中已见报道［13－14］，本试验采用1/2MS诱导获得高生根率也验证了这一点。

果糖有利于提高增殖分化效果;蔗糖对丽格海棠不定芽诱导和增殖的影响没有达到显著水平。魏占才［4］报道了蔗糖对丽格海棠生长效果影响并不大，这与本试验结果较为一致，原因可能是由于外植体不定根诱导是一个能量消耗过程，需要提供一定碳源作为能量供应［15－16］，当光合作用所需的碳源满足其营养物质的临界点时，糖质量浓度的提高也不会增加光合效率。

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