豫杂一号泡桐花药愈伤组织的诱导

韩同丽，牛苏燕，邓敏捷，范国强

(河南农业大学泡桐研究所，河南郑州450002)

利用花药诱导单倍体是利用现代生物技术进行植物品种选育的方法之一．单倍体能够在相对较短的时间内使性状得以纯合，在很大程度上缩短植物育种进程［1］，提供多倍体育种材料，提高目标新种质获得的机率和育种效率．佐藤亨［2］对杨树的花药进行了离体培养，并获得了再生植株．王敬驹等［3］通过花药培养成功获得黑杨单倍体植株。随着花药培养技术的广泛应用，目前在林木研究中已获得了6科7属约40余个种的单倍体植株［4］．泡桐是中国重要的速生用材和绿化树种，具有材质好、易加工、用途广等特点．但由于种质资源匮乏、遗传背景窄等缘故，限制了泡桐新品种的培育．豫杂一号泡桐生长迅速，抗病力强，是优良的种质资源，对其进行花药培养有利于泡桐种质资源的创新．关于泡桐花药培养研究的报道较少，只有台湾泡桐［5］和兰考泡桐［6］花药培养研究的报道．基因型是影响花药培养的主要因素之一，不同基因型植株的花药对培养的反应不同［7，8］．本研究以豫杂一号泡桐花药为试验材料，对影响泡桐花药愈伤组织诱导的关键因子进行探索，旨在为加速泡桐花药遗传改良和新品种培育提供依据．

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验材料为2011-03-10采集于河南农业大学校园内用醋酸洋红染色确定花粉处于单核靠边期的豫杂一号泡桐(Paulownia tomentosa×Paulownia fortunei)花蕾．

1．2 试验方法

1．2．1 花蕾低温预处理 将花蕾放入4℃冰箱，低温预处理0，3，5，7 d后接入MS基本培养基附加NAA 3．0 mg·L-1，6-BA 5．0 mg·L-1的培养基上．在温度为(25±2)℃，光照强度130 μ mol·m-2·s-1，光照时间16 h·d-1的培养室内进行愈伤组织的诱导，25 d后统计出愈率．

1．2．2 初代培养消毒方式优化 将花蕾在自来水下冲洗3～4 min后沥干，迅速剥去花蕾外层花萼，放入体积分数70%乙醇中分别浸泡0，30，60 s;无菌水反复冲洗5次后，在体积分数为0．1%的HgCl2中分别浸泡60 s和120 s．浸泡处理结束后，用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上，吸去多余水分．剥除雏形花冠后用镊子轻轻除掉花丝，挤出完整花药备用．每个处理20瓶，每瓶接种8枚花药，3次重复．7 d后统计各处理的污染率，20 d后统计各处理的褐化率，计算平均污染率和平均褐化率．

1．2．3 诱导培养基的筛选

1．2．3．1 蔗糖质量浓度 将无菌花药接种于附加质量浓度为 10，30，60，90，120 g·L-1蔗糖的 MS+NAA 3．0 mg·L-1+6-BA 5．0 mg·L-1培养基上，14 d和25 d时分别统计出愈率和生长情况确定花药愈伤组织诱导的最适蔗糖质量浓度．

1．2．3．2 激素质量浓度 以 M S为基本培养基(聚乙烯吡咯烷酮质量浓度为1．5 g·L-1，蔗糖质量浓度为 3 0 g·L-1)，附加质量浓度为 0 ，0．5，1．0，2．0，3．0，4．0 mg·L-1NAA 和 2 ．0，3．0，4．0，5．0 mg·L-16-BA．将无菌花药接种于培养基上，每个处理20瓶，每瓶接种8枚花药，每6 d统计1次愈伤组织诱导率(产生愈伤组织的花药数/接种花药总数×100%);30 d时根据诱导率和生长情况确定花药愈伤组织诱导的最适培养基．

1．3 数据处理所有试验数据转换成反正弦后采用DPS(Version 7．05)统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2．1 低温预处理对花药愈伤组织的影响

不同低温预处理时间对愈伤组织诱导率有一定的影响(表1)，随着低温预处理时间的延长，花药愈伤组织的诱导率显著增高，尤其以经过7 d的低温预处理时，花药出愈率最高，达到61．04%，且愈伤组织质地致密，颜色深绿色(图1-A)．说明经过一定时间低温预处理可提高豫杂一号泡桐的花药愈伤组织诱导率．

表1 4℃预处理对花药愈伤组织诱导的影响Table 1 Effect of 4℃on the Callus induction

2．2 不同消毒方式对花药愈伤组织诱导的影响

随着消毒时间的延长，污染率降低，同时褐化率升高(表2)．花药培养5 d左右，部分花药开始出现污染现象．乙醇消毒60 s，HgCl2消毒60 s可以使污染率降低到0．培养20 d后，6号消毒处理褐化率最高，部分花药完全褐化甚至死亡．说明消毒剂在作用一段时间后，外植体表面所带的微生物基本上被消毒剂处理干净，延长消毒时间并不能带来显著的效果．可能是外植体在消毒剂中浸泡时间过长，消毒剂渗入到外植体组织内，在培养的过程中，由于消毒剂的毒害，严重阻碍外植体的代谢生长导致外植体的死亡．污染率与褐化率统计表明，最佳消毒方式是体积分数70%乙醇消毒30 s，体积分数0．1%HgCl2消毒60 s．

2．3 愈伤组织诱导培养基的筛选

2．3．1 蔗糖质量浓度对花药愈伤组织的影响 随着蔗糖质量浓度的升高，愈伤组织诱导率也逐渐升高(表3)．蔗糖质量浓度从10 g·L-1增至120 g·L-1时，愈伤组织诱导率显著增加．在蔗糖浓度为30 g·L-1时，愈伤组织的质地和颜色都明显优于其他处理的愈伤组织(图1-B)．当大于60 g·L-1时，形成的愈伤组织生长速度缓慢，质地疏松，颜色淡黄，并且随着生长会逐渐褐化直至死亡．说明高质量浓度的蔗糖可以提高愈伤组织诱导率，但对愈伤组织的生长有抑制作用，所以最适蔗糖质量浓度为 30 g·L-1．

表2 消毒方式对愈伤组织诱导的影响Table 2 Effect of disinfection methods on the Callus induction

表3 蔗糖质量浓度对花药愈伤组织诱导率的影响Table 3 Effect of concentration of sucrose on the induction rate of anther calli

2．3．2 激素质量浓度对花药愈伤组织的影响 豫杂一号泡桐花药接种4～5 d后，部分花药局部变褐，少量不褐化花药开始膨大并伴有明显的发绿现象．7 d后，部分花药囊开裂处可以观察到白色水滴状透明愈伤组织的生成．12 d后，膨大发绿花药及部分褐色花药囊开裂处或花药与花丝相连处陆续产生淡黄色颗粒状愈伤组织，随着培养时间的增加，花药愈伤组织逐渐增大．将花药接种在附加NAA，6-BA不同质量浓度配比的MS基本培养基上，愈伤组织诱导情况及生长情况不同(表4)．在NAA质量浓度相同的条件下，随着6-BA质量浓度的增大愈伤组织诱导率先增大后减小，6-BA质量浓度过低生长慢，过高则对组织有毒害作用．当6-BA达到5 mg·L-1时，愈伤组织从中部褐化;在不含NAA的情况下，能够诱导出少量愈伤组织，这可能是在花药内源激素作用下产生的，但生长缓慢，随时间的变化而褐化至死亡;以NAA 2 mg·L-1+6-BA 3 mg·L-1组合处理诱导率最高(图1-C)，愈伤组织质地可明显分为浅绿色颗粒状、黄绿色疏松和深绿色紧密状3种状态．

图1 豫杂一号泡桐花药愈伤组织Fig．1 Anter calli from Paulownia tomentosa × Paulownia fortunei

3 小结与讨论

在一些植物的花药培养中，一定时间的低温预处理被认为是必不可少的［9］．本试验中，随着低温预处理时间的延长愈伤组织诱导率显著增高，褐化现象略有减轻，尤其以低温处理7 d时花药愈伤组织诱导率达到最高，表明低温预处理有利于提高花药愈伤组织的诱导率．王震星等［10］进行枣的花药离体培养、李建安等［11］对油茶花药培养愈伤组织和王敬东等［12］对宁夏枣树花药离体培养时也得到类似的结果．

表4 植物生长调节物质对愈伤组织诱导的影响Table 4 Effect of hormone on the induction rate of anther calli

外植体的消毒在花药培养中是十分重要的．在花药培养中，常用的表面消毒剂有体积分数70%乙醇、体积分数 0．1%HgCl2、漂白粉、次氯酸钙等［13］．乙醇效果较好，但对外植体伤害严重;HgCl2对外植体伤害比较轻，一般时间越长，消毒效果越好，但褐化也越严重［14］．在本试验中，考虑到花药本身的特殊性，花药由最外层肥厚多毛的花萼，里层的雏形花冠紧紧包裹，形成一个相对无菌的条件．因而在剥去花萼后立即使用消毒剂处理无须过长时间即可保证消毒效果．接种时只需在超净工作台中除去外层花冠，操作方便简单，节省时间．

蔗糖除了做碳源外，在培养基中还起着调节渗透压的重要作用［15］．提高蔗糖质量浓度可以增加培养基的渗透压，抑制花药壁等体细胞形成愈伤组织，增加花粉粒形成单倍体愈伤组织的频率，有效地提高植物花药培养的成功率，但是渗透压过高对单倍体愈伤组织的诱导和生长具有抑制作用［16］．本试验的结果表明随着蔗糖质量浓度的增加，花药愈伤组织诱导率逐渐提高，当大于60 g·L-1时，形成的愈伤组织生长速度缓慢，质地疏松，随着生长会逐渐褐化直至死亡．因而当获得愈伤组织后，应及时降低渗透压，降低糖源的质量浓度，以加快愈伤组织的增殖．

在植物花药培养中，外源激素种类及比例对花药愈伤组织的形成和生长状况起重要作用［17，18］．本试验中以MS+2 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA组合培养花药愈伤组织生长状况、质地最好．愈伤组织培养30 d之后，随着时间的延长，会出现褐化现象，可能是细胞代谢造成的渗出物积累加剧了愈伤组织的褐化，减短培养基更换周期可减少这一现象的发生．

［1］ 李 英，王 佳，季乐翔，等．植物单倍体技术及其应用的研究进展［J］．中国细胞生物学学报，2011，33(9):1008-1014．

［2］ 佐藤亨．ポプラの药培养にすけるルス诱导と器官分化［J］．日本林学会志，1974，56(2):55-62．

［3］ 王敬驹，朱至清，孙敬三．杨树花粉植株的诱导［J］．植物学报，1975，17(1):56-59．

［4］ 张冰玉，苏晓华，周祥明，等．林木花药培养研究进展及展望［J］．植物学通报，2003，20(6):656-663．

［5］ 何政坤，钟振德，张淑华，等．台湾泡桐花粉球体发育与花药培养［J］．林业试验所研究报告季刊，1993，8(2):99-108．

［6］ 樊万选．兰考泡桐花药培养简结［J］．百泉农专学报，1981(1):32-35．

［7］ 张绿萍，陈红．影响刺梨花药愈伤组织诱导因素的研究［J］．山地农业生物学报，2009，28(1):18-23．

［8］ HÖFER M．In vitro to androgenesis in apple:improvement of the induction phase［J］．Plant Cell Rep，2004，22(6):365-370．

［9］ SATO S，KATOH N，LWAI S，et al．Effect of low temperature pretreatment of buds on inflorescence on isolated microspore culture in Brassica rapa(syn．B．campestris) ［J］．Breeding science，2002，52(1):23-26．

［10］ 王震星，张 磊，刘玉芹．枣的花药离体培养和染色体倍性变异［J］．植物生理学通讯，1998，34(3):180-182．

［11］ 李建安，张日清，石明旺，等．油茶两物种花药培养愈伤组织诱导试验［J］．经济林研究，2003，22(3):36-38．

［12］ 王敬东，陈晓军，张 丽，等．宁夏枣树花药离体培养再生体系的建立［J］．中国农学通报，2011，27(31):174-178．

［13］ 王丽华，陈建华，李昌珠，等．光皮树花药愈伤组织的诱导［J］．经济林研究，2011，29(1):94-98．

［14］ 曾 镭，刘 燕．植物组织培养中褐化问题的研究进展［J］．安徽农学通报，2007，13(14):49-50．

［15］ 张玉芳，岳 岚，何松林，等．观赏植物花药培养的主要影响因素［J］．农业生物技术科学，2008，24(6):58-61．

［16］ 张宝红，刘 方，姚长兵，等．糖源对棉花花药培养的影响［J］．江西农业大学学报，1998，20(3):311-316．

［17］ HÖFER M．In vitro and rogenesis in apple:optimization of the anther culture［J］．Aeta Hoticulture，1997，447:41-45．

［18］ 丁植磊，张日清，刘友全，等．油茶12个物种花药愈伤组织诱导及继代培养［J］．经济林研究，2007，25(1):20-24．