人参皂苷Rb1对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤的保护作用

陈红霞

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

心肌缺血再灌注损伤(MRI)的概念最早由Jennings等［1］提出，在器官的缺血再灌注损伤中，心肌的缺血再灌注损伤发生率最高，也是目前研究最多的器官。再灌注损伤心肌可表现为心肌舒缩功能降低，再灌注性心律失常，心肌能量代谢紊乱和心肌超微结构的改变。但是缺血再灌注损伤的具体机制尚未完全阐明。自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞、血管内皮细胞、细胞黏附分子与细胞凋亡等均可能参与缺血再灌注损伤的发生。大量的基础研究证实缺血预处理能减少缺血再灌注损伤。研究表明人参皂苷Rb1有抗氧化，抗凋亡作用，并且能明显缩小犬急性心肌梗死面积［2］，亦降低心梗大鼠血液粘度，还能降低心肌耗氧，改善冠脉循环［3～5］。但其对心肌缺血再灌注损伤保护的信号转导机制未明。本研究通过人参皂苷Rb1预处理缺血大鼠心肌，观察心肌梗死面积及心肌一氧化氮合酶表达的影响，探讨其减轻心肌缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性Wistar大鼠共40只，体质量220～260g，由湖北科技学院实验动物中心提供。

1.2 药品及试剂

人参皂苷Rb1(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号:1130-050102，纯度≥98%);逆转录cDNA合成试剂盒(TOYOBO公司，由上海谱振生物科技有限公司代购);随机引物合成(Invitrogen公司)，TaqDNA聚合酶、dNTP(Promega公司，由上海玉博生物科技有限公司代购);MDA、SOD及NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 实验方法

40只Wistar大鼠随机分为空白组、再灌注模型组及人参皂苷Rb150mg·kg-1·d-1和100mg·kg-1·d-1组，每组10只。药物组每天灌胃给药1次，连续7d，空白组及再灌模型组给予等体积生理盐水。参照DREXLER［6］方法，复制梗死模型。乙醚麻醉大鼠，从左侧胸骨旁第3～4肋间开胸挤出心脏。在动脉圆锥和左心耳交界处高位结扎左前降支(LAD)后 ，将心脏放回原位，关闭胸腔。30min后松解LAD的结扎线，伤口局部给予青霉素粉剂抗感染，然后缝合皮肤。

1.4 心肌梗死范围测量［7］

再灌注3h后再次阻断冠状动脉血流，注射伊文思蓝进行心肌染色，以区分无蓝色的缺血和蓝色的非缺血组织。迅速将左室心肌取出切成约2mm的薄片，而后分离出未染色的心肌部分(无蓝色)与染色部分(蓝色)并用滤纸吸干，称重，将缺血的心肌切片置于1%TTC磷酸缓冲液内，确定梗死组织范围大小。然后再将灰白色区域(坏死区)和深红色区域(非坏死区)进行分离后，分别测量并计算梗死/缺血的百分比(MIS)。

1.5 NO、SOD 活性及 MDA 含量的检测［7］

取出处死后动物的左心室缺血心肌并研磨成10%的组织匀浆，移入离心管中(3500rpm离心15min)，吸取上清液(移液枪)，4℃储存。用 NO试剂盒测定心肌组织匀浆NO活性，用MDA试剂盒测定心肌组织匀浆MDA含量，SOD试剂盒检测SOD的活性。检测均严格按照试剂说明书操作。

1.6 实时荧光定量PCR检测不同组别心肌组织eNOS mRNA表达变化

引物序列设计如下:eNOS:296 bp，Sense:5＇TAGCTGTGCTGGCAT-ACAGG 3 ＇，Antisense:5 ＇ATGGTCAAGTTGG-GAGCATC 3 ＇;β-act in:159 bp，Sense:5＇CTTAGT-TGCGTTACACCCTTTCTTG 3 ＇，Antisense:5 ＇CT GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3 ＇，反应条件为:首先94℃ 3min变性，接着50个循环，包括94℃ 30s变性，56℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，最后72℃ 7min延伸。全过程在实时荧光定量PCR仪(FT C-2000)中完成，观测并记录扩增曲线并分析Ct值，根据Ct值计算出各扩增产物的相对表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠MIS及心肌组织SOD活性和MDA含量的变化

与空白组比较，再灌模型组大鼠MIS及MDA含量均显著升高(P＜0.01);与再灌模型组比较，人参皂苷Rb150、100mg·kg-1组可见大鼠MIS明显缩小 (P＜0.05或P＜0.01)，心肌组织MDA含量显著降低 (P＜0.05或P＜0.01);与空白组比较，再灌模型组大鼠心肌组织SOD活性显著下降(P＜0.01)，与再灌模型组比较，人参皂苷 Rb150、100 mg·kg-1组可见心肌SOD活性显著升高(P＜0.05 或 P＜0.01)，见表1。

表1 各组大鼠MIS变化和SOD及MDA含量比较(，n=10)

表1 各组大鼠MIS变化和SOD及MDA含量比较(，n=10)

与空白组比较，*P＜0.01;与再灌注组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 MIS(%) SOD(u/mg·ww) MDA(nmol/100mg·ww)0.36 ±0.49 6.13 ±0.65 3.76 ±0.23再灌注组 22.43 ±4.60* 4.67 ±0.79* 4.93 ±0.69*G-Rb150mg/kg组 14.98 ±4.31△ 5.98 ±0.96△ 3.95 ±0.61△G-Rb1100mg/kg组 13.89 ±4.72△△ 6.05 ±1.13△△ 3.81 ±0.36空白组△△

2.2 各组大鼠NO及eNOSmRNA表达的比较

与空白组比较，再灌模型组心肌组织NO及eNOSmRNA表达显著下降(P＜0.05)，与再灌注模型组比较，人参皂苷Rb150、100mg·kg-1组可见心肌组织NO及eNOSmRNA表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，见图1。

图1 人参皂苷Rb1对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织NO及eNOSmRNA表达影响

3 讨论

近年来心肌缺血再灌注损伤已经成为溶栓及动脉搭桥等冠脉再通术治疗急性心肌梗死的重要难题之一，心肌缺血再灌注反而会加重心肌结构的损伤和功能障碍，甚至引起严重心律失常、猝死和心室纤颤等现象。研究表明，心肌缺血再灌注损伤会进一步加大MIS，其心功能障碍程度比急性心肌梗死还严重，病死率更高［8］。目前，缺血再灌注损伤发生的机制尚未完全阐明，研究表明自由基、钙超载、细胞凋亡、中性粒细胞、血管内皮细胞、细胞粘附分子与心肌纤维能量代谢障碍等均可能参与缺血再灌注损伤。临床对心肌I/R损伤的保护方法都是外源性的，如增加心肌氧和能量供应，减轻心脏负担和能量消耗，但是所有的方法都有其不足和副作用。

经多年实验研究和临床应用表明，人参及其提取物人参皂苷能够改善心肌缺血、缩小梗死面积，并且对再灌注损伤有着较好的保护作用［9］。本实验结果进一步说明，人参及其提取物人参皂苷类药物能够上调eNOS进而增加NO的合成，具有快速反应性。从实验数据可以看出，人参皂苷Rb1对心肌细胞存在确切的保护作用，理据如下:表1 中Rb150及100mg·kg-1组MIS均较缺血再灌注组小，而心肌组织MDA含量较再灌注组高，图1中人参皂苷Rb1预处理组心肌SOD活性较再灌注组明显增加。因此我们可以看出人参皂苷Rb1能够通过上调eNOS的表达来抑制受损心肌细胞的坏死，从而发挥其药效。但是目前无法确认人参皂苷Rb1调控eNOS表达的具体途径，其机制仍需进一步的探讨。

［1］Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.My ocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog［J］.ArchPathol，1960，70:68

［2］睢大员，陈满秋，于晓风，等.人参Rb组皂苷对犬实验性心肌梗死的保护作用［J］.中草药，2001，32(2):136

［3］Wu Y，Xia ZY，Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Mol Biol Rep，2011，38(7):4327

［4］覃秀川，睢大员，杨景文，等.人参Rb组皂甙对急性心肌梗死大鼠自由基代谢的影响［J］.吉林中医药，2002，22(3):51

［5］Thirunavukkarasu M，Han Z，Zhan L，et al.Adeno-sh-beta-catenin abolishes ischemic preconditioning-mediated cardioprotection by downregulation of its target genes VEGF，Bcl-2，and survivin in ischemic rat myocardium［J］.AntioxidRedox Signal，2008，10(8):1475

［6］Roque FR，Soci UP，De Angelis K，et al.Moderate exercise training promotes adaptations in coronary blood flow and adenosine production in normotensive rats［J］.Clinics(Sao Paulo)，2011，66(12):2105

［7］陈红霞，赵小玉.普伐他汀配伍参麦注射液干预兔心肌缺血再灌注损伤的实验研究［J］.咸宁学院学报(医学版)，2007，21(2):96

［8］谷腾飞，赵明，蒋鹏，等.参麦注射液对缺血-再灌注损伤大鼠心肌H-FABP和血清FFA的影响［J］.临床麻醉学杂志，2011，27(6):590

［9］Kong HL，Li ZQ，Zhao YJ，et al.Ginsenoside Rb1 protectneonatal rat cardiocytes against CoCl2-induced apoptosis in neonatal rats by inhibiting mitochondria permeability transition pore opening［J］.Acta Pharmacot Sinica，2010，31(6):687