光学表面等离子共振生物传感检测系统检测雌二醇的研究

魏文松，穆琳瑛，李会芹，王 顺，李宏伟，侯金博，江 敏，胡建东

(1．河南农业大学机电工程学院，河南郑州450002;2．河南农大迅捷测试技术有限公司，河南郑州450002;3．河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002)

现实生活中有大量危害环境和人类健康的化 学品不断释放到自然环境中，其中大部分为有机合成物，它们在环境中性质稳定，存留时间长，有较强的生物蓄积毒性甚至有致癌、畸形和致突变等作用，给人类及环境带来极大的危害［1］．其中环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)中的环境雌激素(Environmental estrogens，EEs)已成为环境科学工程研究领域中的一大热点．环境雌激素是进入动物体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物，包括人工合成化合物及植物天然雌激素．环境雌激素中的雌二醇进入人体后，干扰人体内正常激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身激素样的作用，对生物体维持自身内环境的动态平衡、繁殖、生长及行为产生不利的影响，它有明显的致癌性［2，3］，因而对于环境雌激素的检测对于人类和环境都有着极其重要的作用．传统的环境雌激素检测方法主要有气相色谱法，液相色谱法，气相色谱－质谱法，液相色谱－质谱法，荧光分子传感法等［4］．近年来发展起来的光学表面等离子共振技术在食品安全、环境监测、药物筛选和生物医学等领域的应用越来越广泛，与传统的方法相比具有无需标记、非破坏性、快速且能够实现实时检测等特点［5～8］．利用光学表面等离子共振技术，采用竞争抑制方法［9］，作者设计了一种新颖的、无标记、基于光学表面等离子共振(Surface plasmon resonance，SPR)生物传感检测系统，并用于检测环境雌激素中雌二醇，为环境雌激素中雌二醇的快速定量检测提供了一种新颖的方法．

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

十二烷基硫酸钠 (SDS)(美国Sigma公司)，N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)(美国Sigma公司)，1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基炭二亚胺盐酸盐(EDC)(美国Sigma公司)，巯基丙酸(MPA)，乙醇胺(ETH)，PBS缓冲液，牛血清白蛋白(BSA)，含0.1%SDS的 0．1 mol·L－1的 NaOH，N，N'－ 二环己基碳二亚胺(DCC)，二甲亚砜(DMSO)，雌二醇标准品，雌二醇单克隆抗体，高氯酸、氯化钠、磷酸二氢钠、去离子水．所有试剂均为分析纯．

光学SPR生物传感器TSPR1K23从美国Ti公司购买，内部集成封装了光学检测系统．集成光学SPR生物传感器TSPR1K23表面蒸镀50 nm金膜，用于产生表面等离子共振光谱．微流池、便捷式更换芯片夹具、触摸屏、光电转换电路、USB接口板和动力学分析软件均由河南农大迅捷测试技术有限公司研制［10］．

1．2 光学SPR检测环境雌激素中雌二醇的原理

光学表面等离子共振(SPR)生物传感器检测环境雌激素中雌二醇的原理实质是检测结合在金膜表面的分子质量，其原理是将特定波长的光束以一定角度入射到表面蒸镀50 nm金膜的光学基板上，光线从棱镜与金膜界面产生全反射，全反射产生的倏逝波引起金膜内的自由电子产生运动，形成表面等离子波．当表面等离子波的传播常数与入射光波的传播常数相等时，表面等离子波与倏逝波将产生共振，共振时反射光信号在线阵CCD上的产生1个光强最弱的点(用像素点位置表示)，随着抗原抗体的结合，像素位置点发生变化，这是由于结合在金膜表面的分子质量的变化，从而导致发生光学SPR共振角度变化，对应到CCD的像素位置发生变化，因此像素点的位置与附着在光学芯片表面的质量有关．本实验采用竞争抑制方法检测金膜表面微小的质量变化，从而可以获得被测样品中物质含量［11］．光学SPR生物传感器竞争抑制法原理如图1所示．

图1 光学SPR生物传感器竞争抑制法Fig．1 Schematic of competitive immunological detection method

将雌二醇分子通过巯基丙酸固定在传感器金膜上制成分子识别膜．分析时先进行预反应，预反应时在样本中加入定量的雌二醇抗体分子，雌二醇抗体抗体和样本混合后孵育，使样本中雌二醇分子和雌二醇抗体分子结合达到平衡状态，之后再通过光学SPR生物传感器表面分子识别膜检测未被结合的自由抗体分子，抗原浓度越高，分子识别膜上结合自由抗体分子越少，即结合的分子质量与样本中抗原质量浓度成反比关系．

2 光学SPR生物传感检测系统的设计

该光学SPR生物传感检测系统的核心是集成光学 SPR 生物传感器 TSPR1K23［12，13］．它采用的是固定角检测模式，将线阵CCD和LED用不透明的材料封装起来，SPR角的变化则由不同像素位点上信号强度的变化表示．图2为光学SPR生物传感系统原理框图．该系统由以下几个部分组成．(1)集成光学SPR生物传感器TSPR1K23．(2)微流池．由3个微流道构成．(3)蠕动泵．用于对流速精密控制．(4)微电子驱动器．通过驱动器控制蠕动泵将样品传送到微流池．(5)半导体温度检测装置．用于微流池内样品温度控制．(6)ECB板．内嵌一个A/D转换器和2个微处理器:第1个微处理器用来采集线阵CCD的光强信号和对信号进行滤波处理，并根据温度检测装置对微流池内样品的温度进行控制，使其保持在(25±0．5)℃;第2个微处理器通过USB接口发送数据到触摸屏，由触摸屏完成光学SPR响应信号分析、曲线生成和生物分子动态结合和解离分析．

图2 光学SPR生物传感系统构建原理图Fig．2 Schematic configuration of the optical SPR biosensor system

2．1 信号处理电路设计

信号处理电路由嵌入式系统［14］、ECB信号处理电路板、半导体温度控制器、A/D转换器、4501放大器和触摸屏等部分组成［15～18］．信号处理电路如图3所示．

图3 信号处理电路原理框图Fig．3 Circuit diagram of signal processing

处理电路中用2个电源为电路供电，其中电源1为 5 V，为触摸屏、光学 SPR生物传感器TSPR1K23和半导体温度控制器提供电源;电源2为3 V，为4501放大器、A/D转换器和ECB电路板提供电源．处理过程如下:由光学SPR生物传感器TSPR1K23反射出的光强信号由线阵CCD采集到，经由4501运算放大器放大后，通过A/D转换器，转换为数字信号，传输到ECB电路板进行处理，ECB电路处理电路由触摸屏控制系统控制，在触摸屏上完成对信号和数据的实时动力学分析和存储，利用嵌入式系统进行曲线拟合得到RU－t曲线［19］．同时ECB电路板中的微处理器控制半导体温度控制器来控制和调节流通池系统的温度为恒温，包括制冷和制热2个方向，当系统温度超过25℃时，制冷模式启动，降温．反之，温度低于25℃时，制热模式启动，升温．使系统温度维持在(25±0．5)℃范围，保证检测结果不受温度影响．

3 分子敏感膜的制备

3．1 传感器的清洗

采用4%的十二烷基硫酸钠(SDS)对传感器进行超声清洗5 min，之后用去离子水冲洗干净，最后用N2吹干待用．

3．2 金膜表面敏感膜制备

(1)取适量BSA滴于金膜上，静置反应约4 h．(2)用溶于DMSO的DCC和NHS混合物活化雌二醇约1 h后，滴于金膜表面，静置反应过夜．(3)用1 mol·L－1乙醇胺封闭约 20 min．(4)将制备好的敏感膜浸泡在PBS液中，放置冰箱内保．(4)此时完成敏感膜的制备．每一步之后都要用PBS缓冲液清洗，所有步骤均在室温下进行．

4 结果与分析

4．1 标准曲线的建立

将抗体浓度稀释后与不同质量浓度抗原混合(25，50，100，200 mg·L－1)，对混合物依次进行测试得到一定时间段t内不同抗原质量浓度的响应值(RU)的关系(图4)．随着抗原质量浓度依次增加，其响应值依次减小，即抗原质量浓度越大发生共振的时候光强越弱．从图4可以看出，信号响应值随抗原添加量的增加而减少，符合竞争抑制性检测规律，且各质量浓度间具有很好的区分度．

图4 含不同质量浓度雌二醇样品的信号响应值Fig．4 Response value of different concentrations of estradiol antigen samples in the same amount of time

在图4中取适当时间点不同质量浓度雌二醇样品的响应值，并与所对应的抗原质量浓度作图，如图5所示．

对该响应结果做曲线拟合，其线性方程为:△RU=5 200．4 －0．256C，相关系数为 0．997 8．由此可知，当抗体稀释后，仪器响应值和雌二醇质量浓度成反比关系，并且具有很好的线性关系．由此建立了利用光学SPR技术采用竞争抑制方法检测雌二醇的标准曲线．

图5 不同标准质量浓度雌二醇抗原的响应值拟合直线Fig．5 A fitting curve of SPR response values with different standard estradiol antigen mass concentrations

5 结论

本研究基于环境中生物毒素检测新方法的需求，建立了一种基于光学表面等离子共振生物传感检测系统，该生物传感检测系统由集成光学SPR生物传感器、微流池、便捷更换芯片夹具、触摸屏、信号处理电路和USB接口板组成，结构简单，造价低廉，操作方便，用于环境雌激素中雌二醇检测的研究．检测方法基于雌二醇抗体和雌二醇抗原竞争抑制法．分别将 25，50，100，200 mg·L－1的雌二醇添加入雌二醇抗体溶液中进行竞争反应，将反应后的分析物流经光学SPR芯片表面，建立了雌二醇测定标准曲线，其相关系数为0．9978．检测结果显示，该传感检测系统具有较好的稳定性和可操作性，验证了光学表面等离子共振生物传感器及生物检测系统的性能，不仅为环境雌激素中雌二醇的快速定量检测提供了一种新颖的方法，也是对现有检测系统功能的延伸和新系统不断创新的新起点．

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