芝麻粕降解菌株的筛选诱变及鉴定

娄立起，田璨熙，李 磊，谭 军，吴永尧

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

芝麻粕是芝麻取油后的副产品，我国作为芝麻生产大国，仅芝麻饼粕的年产量就在50万t以上，资源十分丰富[1]。芝麻粕中，蛋白质平均含量在40%～46%，氨基酸的含量也十分丰富[2-4]，营养价值高[5-7]，尤其是几种主要必需氨基酸如蛋氨酸、苏氨酸、精氨酸、色氨酸含量均高于其他饼粕[2]。目前对油料蛋白的利用研究主要集中在豆粕、油菜籽粕[8]和面籽粕，对芝麻粕蛋白的利用[9-12]研究较少。芝麻粕降解菌可利用芝麻粕作有机肥料，通过对芝麻粕的降解使得饼粕中的大分子蛋白降解成小分子肽段或氨基酸。笔者从自然界广泛筛选芝麻粕降解菌，并进行诱变和发掘条件优化，旨在为芝麻粕降解菌在农业上的生产利用提供理论和试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 土壤和水样。采集时间为2011年4月，土壤、水样分别采集自湖南农业大学水稻基地、食堂下水道，采集后的样品装入三角瓶中。

1.1.2 培养基 初筛培养基：芝麻粕50 g/L，121℃灭菌25 min；酪素平板培养基：干酪素1 g/L，溶解，加水定容至100 mL并调pH值为7，琼脂2%；种子培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自然pH值；摇瓶培养基：芝麻粕50 g/L，121℃灭菌25 min。LB肉汤培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选 （1）初筛方法：将采集的水样（95∶5） 和土壤 （1∶1） 分别加入初筛培养基中，在37℃、180 r/min条件下于摇床中培养5 d。将发酵液用无菌水梯度稀释，滴加0.1 mL涂布于酪素平板培养基筛选，取透明圈大的菌株接种于斜面，进行复筛。（2）复筛方法：将斜面保存的初筛菌株接入种子培养基中，在37℃、180 r/min条件下于摇床中培养24 h，取5 mL接种于摇瓶培养基中，同样条件下培养48 h[13]。

1.2.2 酶活力及生物量的测定 （1）蛋白酶活力的测定：采用福林酚法[14]，酶活力定义为1 mL液体酶在40℃和pH值为7的条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位，以U/mL表示。（2）生物量的测定：采用平板菌落计数法。

1.2.3 菌株的鉴定 取复筛后的菌株接种于LB肉汤培养基中，37℃培养24 h，提取DNA作为模板进行PCR扩增。16S rRNA基因PCR扩增的2个引物分别为27F （正向引物）：5′—AGAGTTTGATC（C/A）TG2GCTCAG—3′；1492R（反向引物）：5′—GGTTACCTTGTTACGACTT—3′。PCR扩增产物经切胶回收后，由上海美吉生物医药科技有限公司进行基因序列测定。

将上述菌株的16S rRNA基因序列进行Blast比对，分析序列同源性，使用ClustalX1.83软件与GenBank数据库中获得的细菌16S rRNA序列进行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用邻接法（Neighbor joining method）构建系统发育树。

1.2.4 菌株的诱变 用10 mL无菌生理盐水洗脱出发菌株斜面，打散菌体后稀释至102个/mL菌悬液，在紫外灯下进行诱变，15 W、254 nm紫外灯30 cm 照射。设置照射时间分别为 0、20、40、60、80、120、140 s。吸取照射后菌悬液0.1 mL涂布于酪素平板37℃避光培养48 h。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

菌种初筛后得到146株可降解芝麻粕的菌株，通过透明圈大小的比较选取30株进行复筛，结果如表1所示。这些菌株的生物量维持在2.5×108～12.1×108cfu/mL，酶活力在 97～355 U/mL，其中菌株7的酶活力达352.436 U/mL，因此选用菌株7进行下一步研究。

表1 初筛菌种发酵后的酶活及生物量

2.2 菌株的鉴定

复筛出的菌株7的16S rRNA基因序列长度为1 447 bp，将该菌株的16S rRNA基因序列进行NCBI的Blast检索系统同源性检索，结果表明，该菌株与芽孢菌属等细菌的16S rRNA基因序列自然聚类。在检索出的芽孢杆菌序列中，该菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性达99%。根据该菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析的结果，判断将其为枯草芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

2.3 菌株的诱变

图1 LQ16S rRNA基因进化树

将出发菌株7在紫外照射不同时间，结果如图1所示，随着照射时间的延长，致死率逐渐增大，40 s时致死率为86.6%，选取40 s为诱变剂量。菌株经诱变后，从平板上挑选26株进行摇瓶培养，部分菌株蛋白酶发酵后结果如图2所示，菌株4的酶活力明显高于其他菌株，酶活力达587.3 U/mL。选取保存该菌株，并命名为LQ。

图2 紫外诱变致死曲线

图3 诱变后菌株酶活力

3 讨论

菌株LQ经过系统发育学分析确定为解淀粉芽孢杆菌，它是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌。在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，如葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蛋白酶等，有些代谢产物使解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛抑制真菌和细菌的活性[15]。以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株降解芝麻粕粗蛋白的应用尚未见详细报道，菌株LQ对芝麻粕中粗蛋白有较好的降解作用，拓宽了解淀粉芽孢杆菌的应用范围。

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