禁食不同时段下丘脑穹窿周区orexin－A的表达

赵 琳 贾鲲鹏 史 娟 苗乃周＊ 王 璐

（1延安大学医学院人体解剖学教研室；2延安大学附属医院，陕西 716000；3第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室，西安 710032）

增食欲素（orexin）是由下丘脑外侧区（later hypothalamus area，LHA）合成和分泌的具有神经兴奋作用的多肽，是1998年Sakurai等［1］在大鼠脑内发现的，它包括两个单体orexin－A和orexin－B，orexin－B为一线性多肽，而orexin－A具有二硫键环化多肽，具有更稳定的生化结构，在生物学重要性方面比orexin－B更重要。近年的研究表明orexin系统，尤其是orexin－A，具有广泛的生理作用，参与摄食、能量代谢、睡眠－觉醒等生理活动的调节［2］。实验结果显示脑室内注射orexin－A能明显增加实验大鼠的摄食行为，表明orexin－A与摄食密切相关。研究者常采用禁食来研究orexin的激活和变化规律，但禁食多长时间效果最好并无报道。因此本实验采用免疫组织化学染色和灰度测量方法，观察禁食不同时段大鼠下丘脑穹窿周区orexin－A的表达。

材料和方法

1.实验动物和分组

实验采用Sprague Dawley大鼠（由延安大学医学院实验动物中心提供）24只（雄性，体重150－180g），随即分为4组，每组6只。一组为正常对照组，开始禁食时即灌注固定。另外三组分别禁食24h，48h和72h，动物自由饮水，存活相应的时间段后灌注固定。

2.大鼠一般情况观察

包括毛色、皮肤颜色、活动情况和反应灵敏度等，禁食组大鼠分别于禁食开始及禁食结束时各称体重一次。

3.灌注和取材

各组大鼠戊巴比妥钠（80mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉灌注100ml生理盐水，继以400ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）灌注固定，持续1h左右后，取脑，置入含30%蔗糖的PB中4℃过夜。待脑组织沉底后取下丘脑部分行冰冻切片，片厚30μm。

4.免疫组化染色

切片经0.01mol/L PBS（pH 7.4）常规漂洗后，入0.3%H2O2以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭液（博士德公司）室温封闭1h，再依次进行以下处理：小鼠抗orexin－A IgG（1∶1000，Abcam），室温过夜；生物素化驴抗小鼠血清（1∶200，Chemicon），室温孵育4－6h；AB复合物（1∶200，Vector），室温孵育1－2h。以上各步之间均用PBS充分漂洗切片。以上抗体除AB复合物用含0.3%Triton X－100的PBS稀释外，其余均用含0.25%角叉菜胶，0.3%Triton X－100，0.05%NaN3和3%山羊血清的PBS稀释。最后切片常规DAB呈色、裱片、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、封片后，明视野显微镜下观察、计数和拍照。

5.灰度值测量和统计学方法

各只动物orexin－A阳性神经元计数和灰度值测量均选取3张典型切片进行，免疫组织化学染色结果用图像分析系统（Image－Pro Plus）进行处理。用photoshop分析工具对神经元内orexin－A免疫阳性产物的灰度进行测量。所有数据均用±s表示，采用SPSS13.0软件，行t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.一般情况

动物在禁食期间未出现明显异常，禁食24h和禁食48h大鼠毛色正常，无脱毛，反应能力、活动情况等比较正常。禁食72h组大鼠在禁食末期懒于活动，对刺激反应迟钝，毛色灰暗，无光泽，但无脱毛。大鼠体重随禁食时间的延长而逐渐降低，各组大鼠禁食前后体重变化有统计学差异（P＜0.01）（表1）。

表1 各组大鼠禁食前后体重变化（±s）Table1 The changes of the body weight of rats before and after fasting in each group（±s）

表1 各组大鼠禁食前后体重变化（±s）Table1 The changes of the body weight of rats before and after fasting in each group（±s）

＊P＜0.01vs before fasting

组别Groups 禁食前体重（g） The body weight before fasting 禁食后体重（g） The body weight after fasting 24h 173.35±9.24 165.42±8.96＊48h 175.25±8.54 160.88±8.62＊72h 172.54±10.04 144.25±9.84＊

2.免疫组化染色

对照组和禁食组的orexin－A的免疫阳性产物分布相似，主要分布于穹隆周区、下丘脑腹外侧、背侧、后侧区，以穹窿周区最为密集（图1）。细胞呈卵圆形和三角形，胞体及突起轮廓清楚。各只动物orexin－A阳性神经元计数，均选取穹隆周区阳性产物最为密集的3张进行，计算出阳性细胞均数。禁食24h、48h和72h组orexin－A神经元计数明显多于对照组（P＜0.05），但不同禁食组间orexin－A神经元计数比较没有统计学差异（P＞0.05）（图1）。

图1 Orexin－A在下丘脑穹窿周区的表达，A.对照组；B.禁食24h；C.禁食48h；D.禁食72h；3v第三脑室；f穹窿.标尺＝200μm.Fig.1 Immunohistochemical staining of orexin－A in perifornical hypothalamus，Bar＝200μm.A.control group；B.fasting for 24h；C.fasting for 48h；D.fasting for 72h.3V：the third ventricle；f：fornix.

3.灰度值测量

Orexin－A阳性神经元平均灰度值分析结果显示，禁食24h组的灰度值与对照组相比有所下降，禁食48h组的灰度值最低，显示orexin－A免疫染色强度最高；禁食72h组的灰度值有所回升（图2）。禁食48h组与正常对照组、禁食24h和禁食72h组灰度值比较有明显变化（P＜0.05）（图2）。

图2 各组间orexin－A阳性神经元灰度值比较Fig.2 Comparison of grey value for orexin－A immunopositive neurons in four different groups.Con，control；24，48，72h，fasting for 24h，48 h，72hgroups respectively.＊P＜0.05，compared with control，24h，72hgroup respectively.

讨 论

下丘脑是重要的皮质下中枢，是动物调节摄食活动的关键部位［3］。Orexin神经元胞体对称地，不连续地分布于下丘脑背侧、后侧、外侧及穹隆周区。应用脑区损伤的研究证实：内侧区的弓状核（arcuate hypothalamic nucleus，ARC）、腹内侧核（VMN）、背内侧核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMN）、室旁 核 （paraventricular hypothalamic nucleus，PVN）、视 交 叉 上 核 （suprachiasmatic nucleus，SChN）和下丘脑外侧区（lateral hypothalamic area，LHA）皆可影响摄食行为，是下丘脑食欲调节网络的“网络中心”［4］。摄食调节网络的协调性摄食活动是维持动物生命的基本生理活动。下丘脑外侧区是摄食中枢，这个部位损伤可抑制进食，使体重下降，这表明该区域是调节进食和能量平衡的关键部位。

禁食可上调下丘脑orexin mRNA，也上调orexin免疫反应神经元中cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化形式，显示了orexin对摄食状态的功能性应答。用orexin受体拮抗剂能使大鼠摄食量显著减少，也能抑制orexin引起的增食效应［5］，表明orexin是一种促进摄食的增食因子。进一步的功能学实验表明，给大鼠侧脑室、DMN、PVN、LHA和穹隆周区注射orexin－A，可显著提高其进食量，并可引发动物与期待摄食相关的行为学表现［6，7］。Mondal等［8］观察到禁食48h后，与对照组比较，大鼠下丘脑外侧orexin－A含量上升。本文选择了分别禁食24h、48h和72h三个时间段来研究下丘脑orexin－A的表达变化，并进行对比分析。

本实验中，所有大鼠禁食结束后全部存活，禁食期间，各组大鼠无特殊异常表现，其中禁食72h组大鼠，在禁食末期懒于活动，对刺激反应迟钝，毛色灰暗，无光泽。可能是动物在饥饿状态下维持基本生命功能的适应性反应。由于没有能量补充，大鼠体重随禁食时间的延长而逐渐降低，平均每24h减少7－10g，说明禁食可以明显降低大鼠体重。Orexin－A的免疫阳性产物主要分布于穹隆周区、下丘脑腹外侧、背侧、后侧区，以穹窿周区最为密集。禁食24h、48h和72h组orexin－A神经元计数明显多于正常对照组（P＜0.05），说明禁食刺激促进了orexin－A的表达，但不同禁食组间orexin－A神经元计数比较没有明显改变。禁食时，下丘脑“摄食中枢”及相关核团的活动因饥饿明显增强，相应的促食欲因子的合成、运输和释放也应明显增加。进一步的灰度测量显示，禁食48horexin－A阳性神经元灰度值最低，免疫染色强度最高，与对照组、禁食24h和禁食72h组比较有显著统计学差异。禁食24h、禁食72 h组和对照组灰度值相近，但之间比较并没有统计学意义。说明禁食48h对于orexin－A神经元的活化可能是一个比较适宜的刺激。Orexin－A系统虽然胞体分布局限，但其纤维向全脑广泛投射，orexin－A可能通过这种广泛脑区的协同作用，参与摄食及能量代谢的调节。

［1］Sakurai T，Amemiya A，Ishii M，et al.Orexins and orexin receptors：a family of hypothalamic neuropeptides and G protein－coupled receptors that regulate feeding behavior.Cell，1998，92（4）：573－585

［2］Sakurai T.Roles of orexins and orexin receptors in central regulation of feeding behavior and energy homeostasis.CNS Neurol Disord Drug Targets，2006，5（3）：313－325

［3］Kotz CM.Integration of feeding and spontaneous physical activity：role of orexin.Physiol Behav，2006，88（3）：294－301

［4］Abizaid A，Horvath TL.Brain circuits regulating energy homeostasis.Regul Pept，2008，149（1－3）：3－10

［5］Smart D，Sabido David C，Brough SJ，et al.SB23348672A：the first Selective orexin－1receptor antagonist.Brit J Pharmacol，2001，132（6）：1179－1182

［6］Okumura T，Takakusaki K.Role of orexin in central regulation of gastrointestinal functions.J Gastroenterol，2008，43（9）：652－660

［7］Greco MA，Shiromani PJ.Hypocretin receptor protein and mRNA expression in the dorsolateral pons of rats.Brain Res Mol Brain Res，2001，88（1－2）：176－182

［8］Mondal MS，Nakazato M，Date Y，et al.Widespread distribution of orexin in rat brain and its regultion upon fasting.Biochem Biophys Res Commun，1999，256（3）：495－499