不同浓度亳菊水提物对秀丽隐杆线虫脂滴凝聚影响观察

屈长青 宫雯珺 常好才 姬云涛＊

（1抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心；2阜阳师范学院生命科学学院，安徽 阜阳 236041）

肥胖已经成为危害人类健康的一个重要的危险因素，给人类社会造成日益沉重的经济负担［1］。如何科学调控脂肪细胞的大小和脂滴凝聚也越来越引起人们的重视。亳菊主产于安徽亳州、涡阳一带，栽培历史悠久。菊花的抗氧化、抗菌抗病毒、抗心脑血管疾病、抗凝血以及对中枢神经系统的作用一直被人们所认可［2］，但对脂肪代谢的影响尚不清楚。前期本实验室通过罗勒水提物处理线虫，建立了以油红O染色探究线虫体内脂质含量的方法［3］，为探究亳菊对线虫消化道脂滴的影响，本实验同步化培养秀丽隐杆线虫，并用亳菊水提物干预、油红O染色、吸光度测定等手段，其观察结果报道如下。

材料和方法

1.秀丽隐杆线虫及食物

1.1 线虫

N2野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans the Bristol strain N2）及大肠杆菌 OP50（Escherichia coli OP50），由中科院等离子体物理研究所吴李君研究员惠赠。

1.2 药品及试剂

种子培养基、NGM培养基和多种缓冲液的配制参 照 文 献［16］亳 菊 （Chrysanthemum morifolium Ramat，Boju），由抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供。

2.方法

2.1 亳菊水提物溶液

500 ml蒸馏水浸泡25g亳菊24h，100℃水浴45min，纱布过滤1次，滤纸过滤2次，制成生药含量为50mg/ml的亳菊水提物，置于4℃冰箱中备用。

2.2亳菊水提物培养基制作

将亳菊水提物加蒸馏水稀释，配制不同浓度的的亳菊水提物溶液（5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，22mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，40mg/ml），并取代蒸馏水配制含不同浓度亳菊水提物的NGM培养基。

2.3 大肠杆菌的培养及线虫同步化、虫体油红O染色

参照文献［3］

2.4 虫体裂解及分光光度计检测

实验组与对照组EP管中分别加入裂解液，待线虫全部裂解后在490nm波长处测定吸光度（OD）值。OD值反映细胞脂质变化，从而可间接判断线虫体内脂滴含量。

2.5 统计学处理

计量资料以平均数±标准差（±s）表示，采用t检验来检验组间显著性，P＜0.05为差异有显著性。数据处理应用SPSS 17.0for Windows软件包完成。

结 果

1.虫体染色观察

在光学显微镜下观察，经油红O染色处理后，可见线虫体内有明显的油红O着色现象，而未染色的线虫则呈透明状。如图1所示。

2.线虫染色后裂解经萃取所得吸光度值

可见随浓度的提高，线虫体内的OD值呈现出一定的曲线变化。与对照组相比吸光度呈现上升趋势；但在10mg/ml时，出现拐点，吸光度反而随着浓度的上升出现下降趋势；在18mg/ml时吸光度又随着浓度的升高而呈上升趋势；在25mg/ml时又出现短暂的下降趋势后，在30mg/ml时趋于平稳。（如图2所示）

讨 论

线虫是当前国际上研究脂肪积累生理与分子机制的重要模型之一［4］。其原因在于线虫脂肪颗粒主要存储于肠道及皮下细胞，且线虫身体通体透明，利用整体动物便可观察到肠道及皮下细胞脂肪的堆积；线虫脂肪颗粒标记简单，苏丹黑B、油红O可以使固定好的线虫脂肪着色，肠道内的脂肪颗粒可以用Nile Red荧光探针来标记；线虫具有模式动物所应该具有的诸多研究优势，具有丰富的遗传资源与详尽的遗传背景［5－7］。因此，近十年来线虫已成为备受重视的研究脂肪积累的模型动物。

油红O是脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可以特异性地使甘油三酯等中性脂肪着色，从而可直观地显示细胞中的脂滴的位置与数量，再用异丙醇将油红O萃取出来，分光光度法吸光度，可间接反应细胞中脂滴的含量。菊花（Flos Chrysanthemum）为菊科植物菊的干燥头状花序，味甘、苦、性凉。主要功效有散风清热、平肝明目、解毒、降压等，主治风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、明目昏花等。亳菊中富含糖类、黄酮类和绿原酸等成分。亳菊中菊花多糖含量约为18.5mg/g［8］，总黄酮量约为3.56mg/g［9］，绿原酸含量为0.25mg/g［10］。黄酮类化合物中木犀草素－7－O－β－D－葡萄糖苷及芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷的含量较高［9］，这两种物质可被胃肠道相关酶及微生物水解为木犀草素和芹菜素［11］，其中木犀草素可显著抑制高脂饮食诱导的肥胖模型小鼠体重血脂血糖及胰岛素水平的升高［12］，而芹菜素作为一种常见的黄酮类化合物，研究主要集中于抗菌、抗病毒、抗过敏、抗氧化、防护辐射损伤及调节分化等作用［13］，因此本文暂不作讨论。

据此，我们分析亳菊水提物浓度在0－10mg/ml范围内时，以菊花多糖呈近线性增加明显，导致线虫体内脂肪含量增加；在10－18mg/ml范围内时，黄酮类物质、木犀草素和绿原酸物质含量已明显上升，黄酮类物质能降低脂肪含量［13］；绿原酸抑制脂肪合成［14］；所以，在此浓度范围内，线虫体内脂肪含量降低；在18－25mg/ml范围内时，菊花多糖增加的斜率大于黄酮类物质、木犀草素和绿原酸，即线虫利用菊花多糖合成脂肪含量的作用大于黄酮类物质、木犀草素－7－O－β－D－葡萄糖苷、绿原酸抑制的作用，随后，随着浓度的增加，菊花多糖、黄酮类物质、木犀草素和绿原酸等4种物质由于受线虫吸收量的影响，脂肪累积量趋于平稳或饱和。至于亳菊提取物的主要效应成份（木犀草素、芹菜素）以及绿原酸在线虫体内药动学及芹菜素在调节脂肪沉积方面的作用，我们将进一步深入研究。

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