复合益生菌芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化

张媛媛 赵 敏 张 宁

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

社会呼唤绿色、安全的食品，而饲料安全更是食品安全的前提。有理由相信，动物饲料中大量使用益生菌制剂的时代已经来临［1］。芽孢杆菌制剂是一种常用高效益生菌添加剂。枯草芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的模式种具有很多优点，包括耐酸、耐盐、耐高温(100℃)及耐挤压等特性，因而在饲料的加工、贮藏以及通过动物胃肠道酸性环境等的过程中具有较高的稳定性［2］。此外它还具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，对植物性碳水化合物具有较强的降解能力，可促进机体对食物的消化吸收［3］。而凝结芽孢杆菌更是一种具有广阔发展前景的益生菌，它不但具有芽孢杆菌的优点，更兼具乳酸菌的特性，有效地添补了乳酸菌制剂和双歧杆菌制剂耐性差、培养及储存条件苛刻等方面的缺陷［4－5］。Adami and Cavazzoni［6］发现，凝结芽孢杆菌对仔猪粪中的微生物区系有明显的影响，且这种益生菌有利于改善动物的生产性能。因此，本研究选取二者进行联合培养，充分考虑到二者的共性和特性，培养基配方也采用了成本低廉且适用于工业生产的发酵原料，以期在动物饲养中获得更显著的效果并带来更可观的经济效益。

1 材料

菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)1.892，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心;凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)1.200 9，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

培养基 种子培养基:蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 4 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃灭菌20 min;计数培养基:LB琼脂培养基。

主要试剂 工业用废糖蜜(哈尔滨英瑞斯饲料有限公司提供，含糖量为570 g/L)，玉米粉(市售，GB/T 8885—2008)，豆粕粉(哈尔滨英瑞斯饲料有限公司提供，含氮量为76.3 g/L)，玉米浆(哈尔滨英瑞斯饲料有限公司提供，含氮量35.8 g/L)，琼脂(生物试剂，北京索来宝科技有限公司);葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、尿素、NH4Cl、OXOID酵母浸粉(生物试剂，北京鸿润宝顺科技有限公司)、蛋白胨、MgSO47H2O、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、CaCO3、氯化钙(均为分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)。

仪器设备 FLC—3CLEAN BENCH超净工作台(哈尔滨市东联公司)，DGX—9243B—1电热鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)，HZQ—F160型振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，MLS—3020高压灭菌锅(SANYO Electric Co.Ltd.)，HAIER BCD—237F电冰箱(青岛海尔电冰箱股份有限公司)，HZQ—F160A型恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，PHS—3S精密PH计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 试验方法

2.1 培养方法

①菌种活化:将保存于斜面的两株菌种分别转接到新鲜的LB斜面培养基上，37℃培养18 h，置于冰箱中4℃保存，备用。

②种子液的制备:取20 mL种子培养基于100 mL三角瓶中，灭菌后各接入一环活化的菌种，37℃、150 r/min条件下培养18 h。

③摇瓶发酵培养:取100 mL发酵培养基于250 mL三角瓶中，灭菌后接入两种芽孢杆菌各1.5 mL(总接种量为3%)。将三角瓶置37℃、150 r/min振荡培养24 h。

2.2 培养基成分的单因子试验

碳源:分别用20 g/L的废糖蜜、玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、废糖蜜+玉米粉(m(废糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1)等量替代基础发酵培养基中的葡萄糖，制成培养基进行发酵培养。24 h后检测活菌数，确定最佳碳源。

氮源:分别用10 g/L的尿素、豆粕粉、NH4Cl、酵母浸粉、豆粕粉+NH4Cl(m(豆粕粉)∶m(NH4Cl)=1∶1)、玉米浆、(NH4)2SO4等量替代基础发酵培养基中的蛋白胨，制成培养基进行发酵培养。24 h后检测活菌数，确定最佳氮源。

无机盐:分别用4 g/L的硫酸镁、磷酸二氢钾(2 g/L)+磷酸氢二钾(2 g/L)、氯化钙、硫酸亚铁、碳酸钙等量替代基础发酵培养基中的氯化钠，制成培养基进行发酵培养。24 h后检测活菌数，确定最佳无机盐。

最佳碳源质量浓度:在确定最佳氮源和最佳无机盐的含量不变的条件下，分别取质量浓度为10、20、30、40、50、60 g/L 的碳源进行摇瓶发酵培养，24 h后检测活菌数，以确定最佳碳源的质量浓度。

最佳氮源质量浓度:在确定最佳碳源和最佳无机盐的含量不变的条件下，分别取质量浓度为10、20、30、40、50、60 g/L 的氮源进行摇瓶发酵培养，24 h后检测活菌数，以确定最佳氮源的质量浓度。

最佳无机盐质量浓度:在确定最佳碳源和最佳氮源的含量不变的条件下，分别取质量浓度为2、4、6、8、10、12 g/L 的无机盐进行摇瓶发酵培养，24 h 后检测活菌数，以确定最佳无机盐的质量浓度。

上述各试验均作3次重复，结果取平均值。

2.3 正交试验

将单因子试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐，按照L9(3)4正交表设计正交试验进一步优化，每试验进行3次重复。正交试验因素及其水平见表1。

表1 L9(34)正交设计因素表 g·L－1

2.4 发酵条件的优化

采用正交试验优化出的培养基配方，在保证发酵过程中其他发酵条件不变的情况下，对最佳培养时间、温度、初始pH值、转速、接种量、装液量进行逐一优化。每一试验进行3次重复，结果取平均值。

采用平板稀释涂布法［7］进行活菌计数。

采用正交设计助手II对数据进行处理。

3 结果与分析

3.1 发酵培养基成分的优化

3.1.1 不同碳源对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

以m(废糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1的比例混合发酵时，复合益生菌芽孢杆菌的活菌数最高，达到7.71×109CFU/mL;其次是废糖蜜，活菌数达 6.43×109CFU/mL，二者均高于基础碳源葡萄糖的活菌数为6.04×109CFU/mL;而其余碳源的活菌数均低于基础碳源葡萄糖(表2)。废糖蜜、玉米粉作为碳源不但活菌数高且价格低廉，发酵成本低，适用于规模化生产。

3.1.2 不同氮源对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

豆粕粉作为氮源时，复合益生菌芽孢杆菌的活菌数最高，达到6.06×109CFU/mL;其次是基础氮源蛋白胨，活菌数达5.74×109CFU/mL(表2)。其中，无机氮源的活菌数均明显低于有机氮源，可见芽孢杆菌对有机氮源的利用率更高，更适合其生长。选择复合芽孢杆菌生长的最佳氮源为豆粕粉。

3.1.3 不同无机盐对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

分别以m(磷酸氢二钾)∶m(磷酸二氢钾)=1∶1和氯化钙作为无机盐发酵时，活菌数均高于基础无机盐氯化钠，前两者活菌数分别为5.63×109CFU/mL和 5.02×109CFU/mL，而氯化钠为 4.96×109CFU/mL(表2)。其他无机盐活菌数均小于氯化钠。故选择m(磷酸氢二钾)∶m(磷酸二氢钾)=1∶1和氯化钙作为最佳无机盐。

表2 不同培养基成分对复合益生菌芽孢杆菌生长的优化结果

3.1.4 最佳碳源的不同质量浓度对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

最佳碳源的不同质量浓度对复合芽孢杆菌的生长存在一定的影响，选择质量浓度低的碳源时，随着质量浓度的逐渐增加，活菌数也不断提高，当质量浓度达到3%时，活菌数最高，为5.66×109CFU/mL。其后随着最佳碳源不同质量浓度的进一步提高，活菌数逐步缓慢下降并趋于平稳(表3)。故选择3%时的碳源为最佳碳源含量。

3.1.5 最佳氮源的质量浓度对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

当氮源的质量浓度较低时，对复合芽孢杆菌活菌数的影响并不明显，但随着氮源质量浓度的不断提升，当氮源的质量浓度达到4%时，芽孢杆菌活菌数提高到1.02×1010CFU/mL之后缓慢递减(表3)。故选择4%时的氮源为最佳氮源含量。

3.1.6 最佳无机盐的质量浓度对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

最佳无机盐所选取的6种不同的质量浓度对复合芽孢杆菌活菌数的影响并不显著，均能达到6.0×109CFU/mL左右。随着最佳无机盐质量浓度的逐渐增大，活菌数基本保持平稳，变化幅度不大(表3)，故选取最低的质量浓度为0.2%的最佳无机盐便可以满足芽孢杆菌正常的生长代谢。

表3 最佳碳源、氮源、无机盐的不同质量浓度对复合益生菌芽孢杆菌生长的优化结果

3.1.7 正交试验

对单因子试验优化出来的各营养成分做进一步优化，采用L9(3)4正交表进行正交试验，以期找到培养基成分中碳源、氮源、无机盐之间的最佳配比，结果见表4。

表4 培养基优化正交试验表

正交试验优化出的最佳组合为A2B2C1D2，由于该组合并不在以上正交试验所列的9次试验范围内，故对正交试验得出的最优组合进行了验证性试验，试验结果显示:对A2B2C1D2组合的3次试验结果取平均值，活菌数达6.370×1010CFU/mL，高于9次试验中的最高活菌数5.931×1010CFU/mL。故复合芽孢杆菌的最佳培养基配方为废糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化钙2 g/L。极差分析得 RA＞RB＞RC＞RD，可知各因素对复合芽孢杆菌活菌数的影响大小依次为:废糖蜜＞豆粕粉＞磷酸盐＞氯化钙。对正交试验的方差分析表明(表5)，废糖蜜、豆粕粉为显著影响因子，无机盐为不显著影响因子，故选取较低质量浓度的无机盐方可满足益生菌生长的需求。

表5 正交试验方差分析结果

3.2 发酵条件的优化

3.2.1 生长曲线的测定

按试验确定的最佳培养基配方对种子进行摇瓶发酵培养，培养时间为32 h。自接种后每2 h取样1次测定菌液的OD600nm，未接种的培养基作为空白对照，结果见图1。由图1可知，种子液接入发酵培养基后，0～6 h为生长的延滞期;6～16 h为对数期，菌体数量急剧增多;18 h以后为芽孢杆菌的相对稳定期。可见复合芽孢杆菌的最佳培养时间应选在18～26 h之间。

图1 复合益生菌芽孢杆菌的生长曲线

3.2.2 初始温度对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。随着培养基温度的升高，酶促反应的速率也随之增大，代谢水平加快。但温度过高会引起酶类失活，表现为菌体迅速衰老，导致活菌数大幅度降低，影响产量。试验选取25、30、35、40、45、50 ℃作为摇床温度，摇瓶发酵培养24 h，运用平板稀释涂布法进行活菌计数，确定不同温度对复合芽孢杆菌生长的影响。试验结果表明，温度为35～40℃时，活菌数较高，且以37℃时为最高，活菌数可达3.73×1010CFU/mL(表6)。

3.2.3 初始pH值对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

pH值主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性以及营养物质离子化的程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶过程中的pH值难以控制，只能控制发酵液的初始pH值。因此本试验将最佳培养基配方的初始 pH 分别调至 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，摇瓶发酵培养24 h后测其活菌数。复合芽孢杆菌在初始pH值为7.0～8.0范围内的活菌数较高，且以pH=7.5时为最高，活菌数可达5.69×1010CFU/mL(表6)。

3.2.4 接种量对复合益生菌芽孢杆菌生长的影响

接种量的多少与菌株生长周期的长短有关，不同接种量对复合芽孢杆菌活菌数影响较大，接种量过高或过低均会影响活菌数的水平。接种量低，延滞期过长，造成培养周期延长，耗费大量时间;接种量高，细菌对营养成分的竞争力过大，造成菌体因营养供应不足而提前死亡，同样会抑制活菌数的提高，故试验选取2%、4%、6%、8%、10%、15%的接种量进行接种，摇瓶发酵培养24 h后测其活菌数。接种量为8%时，复合芽孢杆菌的活菌数达最高，为3.42×1010CFU/mL(表6)。可见复合芽孢杆菌的最佳接种量为8%。

表6 不同发酵条件对复合芽孢杆菌生长的优化结果

3.2.5 装液量对复合芽孢杆菌生长的影响

装液量的大小主要反映摇瓶内溶氧量的多少，装液量越小，瓶内溶氧则越多。在250 mL三角瓶中分别装入最佳培养基，使得装液量分别为30%、35%、40%、45%、50%、55%，摇床发酵培养24 h后测其活菌数。采用40%的装液量时活菌数最高，为3.84×1010CFU/mL，但随着装液量的增大，活菌数不断下降(表6)。可见溶氧水平越高，则越适合需氧的复合芽孢杆菌生长。在实际生产中，可以根据实际情况，酌情掌握装液量的大小，尽可能使溶氧量增加。

3.2.6 摇床转速对复合芽孢杆菌生长的影响

不同摇床转速对复合芽孢杆菌发酵的活菌数存在一定的影响。随着摇床转速的增大，活菌数得到显著提高，当转速达到160 r/min时，活菌数达到最高，为 4.53×1010CFU/mL(表6)，但进一步提高摇床转速，活菌数则开始逐渐下降，可能由于转速过高会加快细菌菌体的裂解所致。故选定160 r/min为复合芽孢杆菌发酵培养的摇床转速。

4 结论

采用单因子试验及正交试验，在摇瓶中对复合芽孢杆菌的培养基成分进行优化，通过平板稀释涂布法测定培养24 h后的活菌数，以活菌数的高低作为评价指标，得到最优培养基配比为:废糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化钙2 g/L。通过单因子试验确定了最佳培养条件［8］为:起始 pH=7.5、温度 37 ℃、接种量8%、装液量40%、摇床转速160 r/min。通过对复合芽孢杆菌培养基及培养条件的优化后，活菌数得到显著提高，达到6.62×1010CFU/mL。明显高于崔东良等［9］对单株凝结芽孢杆菌工业化发酵培养基初步研究所得的活菌数9.3×109CFU/mL，且成本低廉，更适合于工业化生产。

本试验仅是在实验室摇床培养条件下进行的优化，还需在生产用发酵罐中做进一步验证。对于实际生产中各项发酵参数的设定，也需要做更详尽的研究。

［1］郭兴华.益生菌基础与应用［M］.北京:北京科学技术出版社，2002.

［2］邓露芳，王加启，卜登攀，等.纳豆芽孢杆菌作为益生菌饲用的研究现状［J］.中国畜牧兽医，2007，34(10):5－8.

［3］Schallmey M，Singh A，Ward O P.Developments in the use of Bacillus species for Industrial production［J］.Canadian Journal of Microbiology，2004，50(1):1－17.

［4］Lacroix C，Yildirim S.Fermentation technologies for the production of probiotics with high vability and functionality［J］.Current Opinion in Biotechnology，2007，18(2):176－183.

［5］季奎文，吕学敏，刘东田.动物益生素凝结芽孢杆菌的开发与应用［J］.兽药与饲料添加剂，2006，11(6):17－18.

［6］Adami A，Cavazzoni V.Occurrence of selected bacterial groups in the faeces of piglets fed with Bacillus coagulans as probiotic［J］.J Basic Microbiol，1999，39(1):3－9.

［7］方中达.植病研究方法［M］.3版.北京:中国农业出版社，1999:189－192.

［8］周芳，牟海津，江晓路，等.芽孢杆菌M－21产β－甘露聚糖酶发酵条件研究［J］.食品与发酵工业，2007，33(2):10－14.

［9］崔东良，佟建明，王云山，等.凝结芽孢杆菌工业化发酵培养基初步研究［J］.食品与发酵工业，2007，33(12):73－75.