高通量筛选法在测定腈水解酶活性中的应用

张淑蓉，刘建萍，梁国娟

（1.重庆医科大学药学院，重庆400016；2.重庆市万州区环境监测站，重庆404020）

腈是一类重要的化合物，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成［1－2］，在有机合成中占有极其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法。腈的化学水解因其需要强酸或强碱、高温、高压等反应条件，而且副产物多、产量低、环境污染严重，而大大限制了它在工业上的应用。相反，生物转化法具有条件温和、环境污染小，并能实现化学选择性、区域选择性和对映选择性等优点。生物转化法涉及的酶系主要有腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水解酶可催化腈经一步水解反应生成相应的羧酸［3－6］。目前报道的腈水解酶大都来自微生物［7－9］，虽然微生物种类繁多，但仍然不能满足日益增长的工业需求，有许多具有高催化活性的腈水解酶没有被发掘，因此筛选高活性的腈水解酶具有十分重要的现实意义。烟酸，又名尼克酸，俗称维生素B5，是人体中不可缺少的营养成分［10］。烟酸具有增强细胞新陈代谢、扩张血管、促进人体和动物生长发育的功能［11］，还可作为药物中间体，合成多种有重要用途的酰胺类和酯类衍生物药品［12］。据估计，世界每年对烟酸及其衍生物的需求量大约是22 000t［13］。由于腈化学水解法的局限，近些年来，用生物转化法生产烟酸逐渐引起了人们的兴趣。本文通过高通量筛选法筛选出了具有高活性的腈水解酶131，并将其用于催化3－氰基吡啶水解来制备烟酸。

1 实验部分

1.1 实验材料

腈水解酶，尚科生物医药上海有限公司；3－氰基吡啶（AR），美国 ACROS公司；乙腈（AR）、丙烯腈（AR）、磷酸钠（AR）、磷酸氢钠（AR），上海试一化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪（HPLC－2010A）和质谱仪（LCMS－2010），日本Shimadzu公司；核磁共振仪（400 MHz，d6－DMSO为溶剂），美国Varian公司。

1.3 实验步骤

1.3.1 腈水解酶的高通量筛选 酶的筛选采用尚科生物医药（上海）有限公司自制的高通量筛选预制板［14］，腈水解酶筛选板中通常采用100μL的反应体系，其中每孔中的最终反应条件为：10mg/mL底物，10mg/mL酶，10%有机助溶剂（如果底物不溶于水），pH＝8.0。

酶筛选板各孔中加入90μL去离子水，以防止辅酶变质，将10mg底物3－氰基吡啶溶于1mL去离子水中制备成底物母液，再将10μL底物母液和pH 8.0磷酸钠－磷酸氢钠缓冲溶液分别加入到酶筛选96孔板各孔中，然后将酶筛选板放置于30oC和速度为160r/min的摇床中反应24h。反应结束后，在酶筛选板各孔中加入0.1mL乙腈灭活，震荡5～10min，离心10min（4 000r/min），将乙腈水溶液取出放入新的96孔板，直接用高效液相色谱仪和质谱仪（LC－MS）分析。

1.3.2 酶活测定方法 反应体系终组成：1g/L粗酶液，酶的用量可根据实际情况调整，使反应的转化率达到10% 即可；0.5mL，10mmol/L，pH 8.0的磷酸钠－磷酸氢钠缓冲溶液；50mmol/L丙烯腈。反应条件：30℃、每分钟160转条件下反应0.5h，加入等体积的乙腈，进样量为2μL。产物标准曲线为y＝0.061 9x，y为浓度（mmol/L）；x为峰面积（×104）。

酶活定义：在上述反应条件下，每小时生成1μmol产物所需的酶量为一个酶活单位（U）。

1.3.3 酶催化反应的条件 酶催化反应的模型：

酶水解反应体系包括：0.02g/L腈水解酶粗酶，1g/L的底物3－氰基吡啶，0.5mL，10mmol/L，pH 8.0的磷酸钠－磷酸氢钠缓冲溶液。在30℃、磁力搅拌条件下，反应一定时间后，加入等体积的乙腈，离心后用高效液相色谱（HPLC）测定反应生成的烟酸。

1.3.4 分析方法 反应液中反应物3－氰基吡啶和产物烟酸的量通过高效液相色谱法（HPLC）来检测，色谱柱为C18柱 （4.6mm×150mm，5μm），流动相为A相（含0.1%TFA纯净水）和B相（含0.1%TFA乙腈），梯度洗脱程序为0min（90∶10），3.5min（10∶90），4min （10∶90），流速为1.0mL/min，在254nm波长处紫外检测。底物出峰时间为2.9min，产物出峰时间为2.1min。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2 结果与讨论

2.1 腈水解酶131的高通量筛选

运用高通量筛选法，对比研究了尚科生物医药（上海）有限公司自制的30种腈水解酶。其酶活测定数据见表1。结果表明，有少量的腈水解酶可以催化3－氰基吡啶直接水解生成烟酸，但反应效率不同，其中腈水解酶131的酶活17.6U/mL，比酶活35.2U/mg，转化率最高。因此，选用腈水解酶131进行下一步研究。

表1 腈水解酶测活

底物终浓度（mmol/L）酶终浓度（mg/mL）酶活（U/mL）比酶活（U/mg酶粉）NIT－117 50 0.5 0.47 0.93 NIT－118 50 0.5 2.21 4.42 NIT－119 50 0.5 0.47 0.95 NIT－120 50 0.5 3.70 7.40 NIT－121 20 1.0 0.09 0.09 NIT－122 20 1.0 0.11 0.11 NIT－123 10 1.0 0.01 0.01 NIT－124 20 1.0 0.08 0.08 NIT－125 50 0.5 0.16 0.32 NIT－126 50 0.5 2.79 5.57 NIT－127 50 0.5 1.11 2.22 NIT－128 50 0.5 0.23 0.46 NIT－129 50 0.5 2.60 5.19 NIT－130 50 0.5 0.20 0.40 NIT－131 50 0.5 17.6 35.2 NIT－132 20 1.0 0.00 0.00 NIT－133 50 0.5 2.94 5.88 NIT－134 20 1.0 0.00 0.00 NIT－135 10 1.0 0.20 0.20 NIT－136 10 1.0 0.09 0.09 NIT－137 50 0.5 0.42 0.84 NIT－138 50 0.5 1.07 2.14 NIT－139 50 0.5 2.22 4.44 NIT－140 50 0.5 0.06 0.13

2.2 底物浓度对反应速率的影响

主要考察不同的底物浓度对腈水解酶131催化3－氰基吡啶水解反应速率的影响。图2表明，当底物质量浓度小于8g/L时，反应速率随底物质量浓度的增加而加快，当底物质量浓度为8～10g/L时，反应速率达到最大，再增大底物浓度，则反应速率变小，可见底物3－氰基吡啶对腈水解酶131有一定的抑制作用。

2.3 产物的分离

反应结束后蒸干反应液中的水，加入乙醇，加热回流，然后热过滤。合并滤液，蒸干溶剂后，即得到粗品。加入少量水加热溶解粗品，然后低温重结晶，过滤回收晶体，即为产物纯品，收率约为85%。

图2 底物浓度对腈水解酶131催化3－氰基吡啶水解反应的影响

2.4 产物的鉴定

分别用质谱和核磁验证产物的正确性，分析数据为：ESI－MS m/z：124［M ＋ H］＋给出分子量为123；1HNMRδ/10－6：7.5（s，1H，Ar—H）、8.2（s，1H，Ar—H）、8.7（s，1H，Ar—H）、9.0（s，1H，Ar—H）、13.2（s，1H，COO—H）。

3 结论

应用高通量筛选法筛选出的腈水解酶131的酶活为17.6U/mL，比酶活为35.2U/mg，转化率最高。在30℃，pH 8.0，底物质量浓度为8～10g/L时，腈水解酶131能直接催化3－氰基吡啶水解生成烟酸，没有副产物烟酰胺生成，收率约为85%。并用质谱和核磁验证产物烟酸结构的正确性。反应中使用的酶易于低成本制备，不需要昂贵的设备，也无环境污染问题，反应及后处理过程简单，易于放大。虽然这只是初步研究结果，转化过程还有待进一步优化，但足以证明生物催化技术应用于烟酸制备中的可行性，为烟酸绿色工艺的发展提供了新的思路。

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