奶牛粪样中致病性大肠埃希菌的分离与鉴定

张天华，敖日格乐，王纯洁，斯木吉德，满 达，孙和涛

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学动物医学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

大肠埃希菌（E.coli）通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠埃希菌对人和动物有致病性，尤其对婴儿和幼畜（禽），不论在发达国家还是发展中国家，大肠埃希菌仍是新生儿败血症的常见致病菌[1]。相关资料显示，鸡大肠杆菌病的发病率占鸡细菌性疾病的33%，居首位[2]；由大肠埃希菌引起的仔猪腹泻，主要指仔猪黄白痢，在养猪场中有较高的发病率和病死率；人们通过消费处理不当的牛产品感染大肠埃希菌，其中甚至包括对人类健康极度危险的出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合征（HUS）等疾病，是由于食用牛肉和牛奶而发生[3－4]；现阶段奶牛乳房炎发病率较高，原因是由许多革兰阳性菌和革兰阴性菌引起的，在革兰阴性菌中，由致病性大肠埃希菌引起的奶牛发病率较普遍。主要是由于胃肠道下端的致病性大肠埃希菌，随粪便排出后，导致环境污染，引起动物发病。但国内报道从健康牛的粪中分离到致病性大肠埃希菌的报道很少，而且致病性大肠埃希菌血清型众多，分布复杂，具有很强的存活率，如果不及时采取有效防控措施，会给人类和动物带来很大的危害，早发现、早控制成为首要重任。为了更早、更快的发现病因，对健康牛的粪中大肠埃希菌的研究迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样 新鲜粪样采集自内蒙古包头市萨拉齐侯家营奶牛场77头外表健康成年泌乳荷斯坦奶牛。

1.1.2 培养基 伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂、营养肉汤等购自广东环凯生物科技有限公司。

1.1.3 生化鉴定管 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、卫茅醇、尿素、葡萄糖磷酸盐胨水、硝酸盐（还原）、半固体琼脂、三糖铁琼脂等购自广东环凯生物科技有限公司。

1.1.4 实验动物 选用18g～22g健康的昆明小鼠（雌雄性各半），购自内蒙古大学实验动物研究中心。

1.1.5 大肠埃希菌标准抗O血清 购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 粪样的采集 用无菌橡胶手套从77头外表健康成年泌乳荷斯坦奶牛肛门采集直肠新鲜粪样，分别装入标记好的无菌封口袋中立即送实验室。

1.2.2 细菌分离纯化培养 用接种环取采集的新鲜粪样接种于伊红美蓝琼脂，37℃培养24h后，挑取EMB琼脂平板上紫黑色带金属光泽的单个可疑菌落接种于普通琼脂斜面37℃培养24h后获得纯培养，镜检并4℃冰箱保存备用。挑取EMB琼脂平板上紫黑色带金属光泽的单个菌落涂片，革兰染色镜检观察菌落的形态及染色特性照相并做记录。

1.2.3 生化试验 按生化鉴定管使用说明书进行鉴定。

1.2.4 动物致病性试验 取过夜培养肉汤菌液（细菌浓度1×108个／mL），试验组小鼠腹腔接种0.2 mL／只，阴性对照组注射灭菌营养肉汤0.2mL／只，每个菌株攻2只试验小鼠。观察小鼠发病和存活情况，并在小鼠死亡后，立即取心血、肝脏、脾进行细菌分离鉴定。

1.2.5 血清型分型 按照大肠埃希菌O抗原定型血清说明书进行鉴定，采用玻板凝集试验方法。将普通琼脂斜面培养物用5g／L石炭酸生理盐水2 mL洗下，置121℃高压蒸汽灭菌2h，制成凝集抗原之后，将高压抗原与大肠埃希菌O抗原定型血清各取一铂耳置玻板上混匀，30s内出现明显凝集者为“阳性”反应，反之为“阴性”反应。同时以凝集抗原与5g／L石炭酸生理盐水混合物作对照。

2 结果

2.1 培养特性

分离菌在伊红美蓝培养基上生长良好，均为紫黑色带金属光泽、光滑、湿润、隆起的中等大小圆形菌落，在三糖铁琼脂斜面培养基上，底层由红色变为黄色、产气，斜面由红色变为黄色。

2.2 形态特性

分离菌经革兰染色镜检可见中等大小革兰阴性红色短杆菌，两端钝圆，单个或成对散在排列。

2.3 生化试验

分离到69株疑似大肠埃希菌，经生化特性鉴定结果分析，符合大肠埃希菌的特性。因此，证明此69株疑似大肠埃希菌是致病性大肠埃希菌（表1）。

2.4 动物致病性试验

分离菌的动物致病性试验结果表明，69株分离菌中12株均在16h～27h内致死实验小鼠，阴性对照组小鼠全部存活，7d后剖检未见有病变。试验组小鼠死前均可见昏睡、厌食、被毛蓬松、精神萎靡、尾巴和腹部发钳、呼吸急促、四肢僵直直至死亡。剖检死亡鼠，腹腔内有纤维性渗出物，胃肠膨胀，肝肿大，表面有小出血点，心包膜、肾有不同程度的出血。将其心血接种于EMB琼脂上培养后，均符合注射分离菌培养特征。

2.5 血清学鉴定结果

对分离的12株牛源致病性大肠埃希菌进行“O”血清鉴定，分属7种血清型（表2）。

表1 大肠埃希菌菌株生化特性鉴定结果Table1 Biochemical characteristics of E.coli strains

表2 包头市牛源致病性大肠埃希菌O血清型（株）Table2 O serotype of bovine pathogenic E.coli isolates from Baoto city

3 讨论

本试验对内蒙古包头市侯家营奶牛场77头成年泌乳荷斯坦奶牛的新鲜粪样进行了大肠埃希菌的分离培养。经形态特征、培养特性的研究，共分离出69株疑似大肠埃希菌菌株。小鼠致病性试验结果表明，69株疑似大肠埃希菌中12株为致病性菌株，16h～27h内致死全部小鼠，证明这些菌株毒力较强。12株致病性大肠埃希菌的血清型分别为O78、O6、O9、O98、O1、O8、O149等7种血清型。与斯木吉德等[5]对包头市某奶牛场中致病性大肠埃希菌的6种血清型 O78、O2、O8、O86、O35、O1和于俊娥等[6]对呼和浩特某奶牛场中致病性大肠埃希菌的3种血清型O1、O2、O8相比，O1型分布最广泛，其次为O78、O8、O2。以上研究说明，大肠埃希菌的血清型及分布较为复杂，不同的地区存在有相同的血清型如O1，同一地区不同的奶牛场存在有不同的血清型，如侯家营的 O149、O98；其他奶牛场的 O86、O35。建议各地在进行大肠埃希菌病的免疫预防接种时，所用疫苗的血清型一定要与当地流行菌株相吻合。

大肠埃希菌的抗原构造及血清型极为复杂，按抗原成分不同，可将病原性大肠埃希菌分为许多血清型。血清型与致病性有着密切的关系，有些血清型只能引起一种动物发病，而另一些血清型则能引起多种动物发病。本次试验分离鉴定出7种大肠埃希菌O抗原血清型，分属于O78、O6、O9、O98、O1、O8、O149，据文献报道致病性大肠埃希菌血清型中，O78、O1、O35、O2等 4 种血清型为优势血清型[7]，而本试验中也鉴定出了O1和O78两种血清型。O78能引起犊牛败血症[8－9]，鸡坏死性肠炎[10]；O8、O9、O149可致初生仔猪腹泻，与国外报道相符[11]；O98可以引起奶牛乳房炎[12]，但O6引起的大肠杆菌病的报道极为少见，有待进一步的研究。

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