蒲公英内生真菌PG23抗癌活性的初步研究

孙新城，李 丹，罗 宇，张慧茹，3＊

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2.河南工业大学，河南 郑州 450001；3.郑州大学，河南 郑州 450001）

药用植物内生真菌（endophytic fungus）是一类自然界中存在的、能产生多种生物活性物质的新型微生物药物资源[1－2]。人们发现植物内生真菌与宿主长期共生，也能产生出植物抗癌物质，如黄酮类、萜类、生物碱类、多糖、肽类等[2]，因此，研究内生真菌的次级代谢产物，从中寻找新型的抗癌、抗病毒、抗氧化的微生物药物，具有诱人的应用前景。

蒲公英是一味清热解毒类中草药，具有抗菌[3]、抑癌和抗突变[4]、抗氧化[5]等多种药理作用，并能提高免疫功能低下小鼠的免疫力[6]。张慧茹等[7]从蒲公英中分离出3株具有抗菌特性的蒲公英内生真菌，并对其抑菌活性物质进行分析，初步判定为多糖类物质[8]，研究发现，蒲公英内生真菌PG23具有抗菌、消除耐药质粒的生物活性，并且无急性和致死性毒性，其发酵液主要含有糖类、酚类、有机酸类等生物活性物质[9]。为检验蒲公英内生真菌PG23多糖类物质的抗癌作用，本研究通过PG23发酵液对A549细胞的抑制作用，探讨其抗癌作用，为其应用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

蒲公英内生真菌PG23，河南工业大学生物工程学院动物生理实验室分离并保存；A549细胞株，购自美国 ATCC细胞库；RPMI－1640、胎牛血清（FBS），购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、胰酶，均购自美国Sigma公司；环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药公司生产；葡萄糖，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；0.1g／mL的蒲公英浸汁，自制；豆油、玉米粉、马铃薯，均为市售。

1.2 方法

1.2.1 PG23发酵液的制备及粗多糖的提取 将保存的PG23菌种接马铃薯固体培养基平板活化；以马铃薯浸出液为基础培养液，制备种子液；在基础培养基中添加2.6%葡萄糖、0.53%豆油、0.10%玉米粉、7.06%蒲公英浸汁（0.1g／mL）作为发酵液体培养基，接种10%的种子液，26℃、160r／min发酵7 d。发酵液8000r／min离心20min，取上清液1000 mL，950mL／L乙醇沉淀得沉淀物，挥干，称重计算粗多糖得率，粗多糖得率（%）＝粗多糖克数／1000×100%。将所得粗多糖溶于500mL无菌水中作为储备液，4℃贮藏备用。

1.2.2 PG23粗多糖含量的测定 精密称取已干燥至恒重的葡萄糖0.1g，配制成100μg／mL葡萄糖溶液，准确量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖溶液加蒸馏水至1.0mL，各管加5g／L的苯酚溶液1.0mL摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，沸水浴15 min后冷却，酶标仪测490nm处吸光度值（OD值），以葡萄糖浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。准确量取1.0mL发酵储备液，稀释至200倍，取稀释液1.0mL，按上述方法操作，于490nm处测吸光值，对应标准曲线，计算稀释液中多糖含量，并计算储备液中多糖含量，多糖含量（%）＝测量得出的稀释液中多糖含量／沉淀溶解在储备液中的含量×100%。

1.2.3 细胞培养 将A549细胞以5×105个／mL浓度接种于直径为9cm培养皿中，加入含200 mL／L FBS的 RPMI－1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔日更换培养液，待细胞生长近80%融合时，用胰酶消化传代、扩增，取对数生长期细胞用于试验。

1.2.4 MTT法检测PG23多糖对肺癌细胞A549细胞的增殖抑制率及IC50取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2.0×104个／mL接种于96孔培养板中，每孔200μL，培养24h后，弃去培养液。以RPMI－1640培养液为稀释液，将多糖稀释液进行倍比稀释，获得1组～8组分别为原液、稀释2－1、稀释2－2、稀释2－3、稀释2－6、稀释2－9、稀释2－10、稀释2－11共8组含不同粗多糖浓度的培养液，每孔加培养液200μL，以不加药的细胞培养作为阴性对照，以100μg／mL环磷酰胺（CTX）作为阳性对照，以不加药的培养基作为空白对照，每个药物浓度设8个平行，分别培养24、48、72h后，吸去上清，加入5mg／mL的MTT每孔20μL，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入DMSO 200μL，振荡10min，用酶标仪测490nm波长下各孔的吸光值（OD值），计算PG23多糖对A549细胞的抑制率。

抑制率（IR）%＝（阴性对照组平均OD值－试验组平均OD值）÷（阴性对照组平均OD值）×100%；

根据抑制率，利用PASW Statistics 18软件计算蒲公英PG23多糖抑A549肺癌细胞的IC50。

1.2.5 统计学分析 采用PASW Statistics 18软件进行统计学处理。计量数据以¯X±SD表示，One－Way ANOVA 分析、Duncan＇s检验，以P＜0.05（或P＜0.01）表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PG23发酵液多糖含量的测定

以葡萄糖为标准品，采用苯酚－硫酸法，绘制葡萄糖标准液在490nm处吸光值的标准曲线（图1），求得标准回归方程为A＝0.0098C＋0.0233，线性相关系数R2＝0.9931。

用950mL／L乙醇沉淀PG23发酵上清液，获得27.54g粗多糖，多糖得率为2.754%。

取多糖稀释液在490nm处的吸光值为0.747，多糖稀释液的糖含量为73.85μg／mL，故PG23多糖储备液的多糖为14.77mg／mL，粗多糖的含量为26.82%。

图1 葡萄糖含量的标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose content

2.2 PG23发酵液对A549生长的抑制率和IC50

以RPMI－1640为稀释液，将多糖稀释液进行倍比稀释，各培养液中多糖含量见表1。

表1 各组培养液中多糖含量Table1 Polysaccharide contents in different groups mL

以上述培养液为A549肺癌细胞培养液，以100 μg／mL环磷酰胺（CTX）作为抗癌药物的阳性对照，以不加药的培养细胞作为阴性对照，培养24h、48h、72 h，采用MTT法测定吸光度（OD值），计算PG23多糖对A549细胞的抑制率（表2）。

从表2中可以看出，各组A549细胞随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增加；PG23多糖对A549细胞的抑制率以第1天最强，CTX也表现同样的抑制A549细胞的趋势；不同的多糖浓度对A549的抑制率有所不同，第1天第5组（0.23mg／mL）、第6组（28.85μg／mL）、第7组（14.42μg／mL）三组培养液对A549的抑制率超过80%，为高度抑制（P＜0.01），第8组（7.21μg／mL）的抑制率超过50%，为中度抑制，这四组培养液的抑制率均高于CTX阳性对照，第4组（1.85mg／mL）培养液的抑制率同CTX阳性对照相当，为49%，而第2组（7.38mg／mL）和第1组（14.77mg／mL）培养液不仅抑制率下降明显，第1组培养液还表现促进细胞生长的趋势（图2）。

表2 PG23多糖对A549的抑制率Table2 The inhibitory rate in A549cells after treatment with polysaccharide from PG23broth

图2 多糖浓度与抑制率的相关性曲线图Fig.2 The relativity curve between polysaccharide concentration and inhibited rate

根据抑制率，用PASW statistics 18计算PG23发酵液多糖对A549抑制率的IC50为1.073mg／mL（24h）。

3 讨论

多糖类物质具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种功效，多糖作为药物最初是在食用真菌方面，例如，虫草多糖、灵芝多糖、香菇多糖、猴头多糖和灰树花多糖等等，通过淋巴细胞、巨噬细胞和网状内皮系统调节机体的免疫功能，提高身体抵抗病毒和细菌入侵的能力[10－11]，食用菌多糖有着极强的抗氧化特性，能够清除多种自由基对人体的伤害，通过提高机体溶菌酶、SOD、CAT的含量发挥抗氧化、抗衰老功能[12]。

对于药物植物内生真菌产抗癌性多糖类物质的研究国内外并不多见。蒲公英是一类清热解毒类常用抗菌、抗病毒类药物，其药性成分比较复杂，多种成分相互协调发挥多种生物活性作用，对于蒲公英内生真菌的研究，目前仅限于笔者，在研究出PG2的抗菌物质主要为多糖后，后续分离的PG23菌株具有多种生物活性，其发酵液中也含大量的多糖类物质，经测量多糖含量为0.23mg／mL，通过研究发现，蒲公英内生真菌发酵液多糖的抗癌效果并不与多糖浓度成正比，而是具有最佳作用浓度，抑制A549肺癌细胞的最佳多糖浓度为14.42μg／mL，远远高于蒲公英多糖的抑癌效果[4]；在作用后24h内，230μg／mL ～14.42 μg／mL的PG23多糖浓度抑制A549肺癌细胞的抑制率（84.45%～63.96%）均高于环磷酰胺的阳性对照（49.47%），通过计算，IC50为1.073mg／mL，远远低于山茱萸多糖对 A549的IC50（37.2mg／mL）[13]，证明PG23发酵液具有较好的抑制肺癌A549细胞的效果。PG23对肺癌A549细胞的抑制作用机理，以及PG23多糖的其他生物活性还需要进一步深入研究。

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