副猪嗜血杆菌OMP P5间接ELISA 抗体检测方法优化

臧莹安，黄彩梅，李婉雁，李 淼，宋 帅，李春玲＊

（1.仲恺农业工程学院动物科学系，广东 广州 510225；2.广东省农业科学院兽医研究所，广东 广州 510640；3.广东省兽医公共卫生公共实验室，广东 广州 510640）

副猪嗜血杆菌（HPS）一般条件下难以分离和培养，尤其是应用抗生素治疗过病猪的病料，因而给副猪嗜血杆菌病的诊断带来困难。与其他检测方法相比，酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简单、反应速度快、检测结果准确等优点，很适合应用于实践。国内外采用ELISA对HPS进行检测研究的为数不少，但都以全菌研究为主，尚未见有针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5（OMP P5）的间接ELISA抗体检测方法。且操作过程中加样作用时间也不尽相同，其中以30、60、120min居多。对酶标二抗反应时间的选择也各有差异，其中以30min和60min为反应时间的较多[1－2]。造成检测操作时间过长，结果不够稳定，差异较大。目前，尚未找到一种理想的ELISA抗体检测方法。

外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是副猪嗜血杆菌的主要毒力因子之一[3]，是革兰阴性菌外膜的主要结构，占其全部组成的一半，在维持外膜结构，保证物质运输，作为大肠菌素、噬菌体受体以及参与F因子结合等方面均有重要的作用。许多致病菌的OMP具有良好的免疫原性，可同时激发机体的体液免疫和细胞免疫，具有异种血清型的免疫交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原[4]。研究结果显示，OMP P5蛋白具有丰富的二级结构，其β2转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白无跨膜区，提示该蛋白可能实现较高量及可溶性的表达。HPS OMP P5很有可能成为检测或诊断副猪嗜血杆菌病的候选抗原，作为一种临床上诊断HPS的新手段[5]。

本研究将重组表达纯化的副猪嗜血杆菌P5蛋白（OMP P5）作为包被抗原，对已有间接ELISA抗体检测方法的最佳封闭条件、最佳加样作用时间、酶标二抗反应时间进行优化探索。应用优化后的方法对进行和未进行HPS免疫的健康猪的血清样品进行检测，以考察该方法的可靠性，进一步对猪场送检血清进行检测以验证该方法的应用效果，为研制具有自主知识产权的相关副猪嗜血杆菌检测试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清 抗原为HPS OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白，广东省农业科学院兽医猪病研究室制备；HPS标准阳性血清、HPS标准阴性血清、待测血清，采自本试验饲养的未进行HPS免疫的健康猪；待检血清，来自广东地区猪场HPS免疫的健康猪。

1.1.2 主要试剂 四甲基联苯胺（TMB），牛血清白蛋白（BSA），辣根过氧化物酶（HEP）标记羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG等。

ELISA所用溶液：包被缓冲液（0.05mol／L碳酸盐缓冲液pH9.6）；封闭液（牛血清白蛋白1g加入100mL的包被液中混匀，现配先用）；洗涤缓冲液（PH7.4PBST）；抗体稀释液（0.5g BSA 溶解于100mL PBST中）；底物缓冲液（DMSO）；TMB底物显色液；终止液（2mol／L H2SO4）。均用分析纯试剂配制。

1.1.3 仪器和设备 PSX－280B手提式高压灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂；单人双面净化工作台，购自苏州净化设备有限公司；680酶标仪，购自BIO RAD公司；FC－16C高速离心机，购自ZENTRIFUGEN；恒温振荡培养箱购自哈尔滨市东明医疗仪器厂；96孔酶标板，购自美国COSTAR公司。

1.2 方法

1.2.1 供试血清的制备 用一次性注射器从猪前腔静脉或耳缘静脉采集血液5mL／头（不加抗凝剂），室温静置2h～6h后，5000r／min离心5min，取上清液置于EP管中。处理好的血清置于冰箱中3℃～4℃保存备用。其中，所内饲养的已进行和未进行HPS免疫接种的健康猪各10头，某猪场送检血清90份。

1.2.2 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）的建立

1.2.2.1 基本操作程序 用包被液以1∶500稀释度稀释抗原液，100μL／孔加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，洗涤。封闭后加样，100μL／孔加入用抗体稀释液按1∶100稀释的血清，洗涤后加入用1∶5000稀释液稀释的酶标二抗，再加显色液、终止液，最后测定各孔OD450nm值。

1.2.2.2 最佳加样作用时间的确定 ELISA抗体检测试验加样作用时间点分别设为15、30、45、60、75、90、105、120min，各点设3次重复。设各阴性检测孔OD450nm为N，阳性检测孔OD450nm为P，计算出P／N值平均值。结果判定[5]：选择阳性血清OD450nm／阴性血清OD450nm比值（P／N）最大的时间点为最佳加样作用时间。

1.2.2.3 最佳酶标二抗反应时间的确定 ELISA抗体检测试验酶标二抗反应时间点分别设为15、30、45、60min。具体操作与结果判定同1.2.2.2。

1.2.2.4 HPS OMP P5抗体检测 用同一批制备的抗原包被酶标板，取标准阳性血清和标准阴性血清各3份，待检血清10份进行ELLSA批内重复试验。测定其OD450nm值，计算P／N。

用不同时间包被的酶标板，取标准阳性血清和标准阴性血清各3份，待检血清10份进行ELLSA批间重复试验。测定其OD450nm值，计算P／N。

判定标准：如样品P／N值＞（标准阳性血清OD450nm－空白 OD450nm）／（标准阴性血清OD450nm－空白OD450nm）＝3.29，则判断为阳性，反之则判断为阴性。

2 结果

2.1 最佳加样反应时间的确定

由表1可知，反应时间在15、30、60min的P／N值较之于其他加样时间的P／N值高且稳定。并且，在15min时的P／N值显著比其他时间的P／N值高（P＜0.01）。所以，最佳加样反应时间为15min。

2.2 最佳酶标二抗反应时间的确定

为了排除加样反应时间对酶标二抗反应时间的影响，以较为适合的加样反应时间（分别为15、30、60min）进行检测，酶标二抗反应测试时间点分别为15、30、45、60min。表2结果显示，在15min时的P／N值显著高于其他时间的P／N值（P＜0.01），最佳酶标二抗反应时间为15min。加样反应时间与酶标二抗反应时间具有一定的相互独立性。

2.3 送检血清样本检测结果

2.3.1 已进行和未进行HPS免疫的健康猪群检测结果 应用已优化最佳加样作用时间和酶标二抗反应时间的间接ELISA检测方法对已进行和未进行HPS免疫接种的健康猪群进行HPS OMP P5抗体检测，结果显示，未进行HPS免疫接种的检测血样中均为HPS抗体阴性，已进行HPS免疫接种的检测血样中为HPS抗体阳性的达到95%。

表1 最佳加样反应时间的确定Table1 The determination of the best sample reaction time

表2 酶标二抗反应时间的确定Table2 The determination of the best enzyme standard reaction time

2.3.2 对某猪场90份送检血清检测结果 应用已建立的HPS间接ELISA抗体检测方法对某猪场90份血清的OMP P5进行检测，结果见表3。猪场送检的血清中阳性血清检出率高达80%，其中母猪的阳性率较低（30%），保育仔猪阳性率较高（90%），育肥猪和哺乳仔猪高达100%。

表3 90份送检血清OMP P5ELISA抗体的检测结果Table3 ELISA Ab test results of OMP P5of 90sera

3 讨论

随着养猪业的快速发展，副猪嗜血杆菌对我国各猪场危害日趋严重。急需一种有效、快速的诊断方法[6]。目前，检测HPS的方法很多，间接ELISA方法是血清学检测方法中较为敏感、特异的方法[7]。选择合适的包被抗原是建立间接ELISA检测方法的关键。在目前的大多数研究中，还是以全菌研究为主，也许是由于半菌的毒力不足以达到相应的毒力，进而影响到试验结果[8－9]。某些细菌的不同血清型间有相同的OMP免疫原性，可以产生交叉保护作用，这不仅为开发OMP亚单位疫苗提供了理论基础，而且为疾病的诊断提供了特异性抗原，今后必将成为细菌领域的研究重点之一[10]。研究结果显示，OMP P5蛋白具有丰富的二级结构，其β2转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白无跨膜区，提示该蛋白可能实现较高量及可溶性的表达。HPS OMP P5很有可能成为检测或诊断副猪嗜血杆菌病的候选抗原，作为一种临床上诊断 HPS的新手段[5]。

国内外采用ELISA方法对HPS进行检测研究的为数不少，但从未见有针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5（OMP P5）的间接ELISA抗体检测方法。文献中采用的操作过程中加样作用时间也不尽相同，其中以30、60、120min居多。对酶标二抗反应时间的应用也各有差异，其中以30min和60min为反应时间的较多[1－2]。造成检测时间长，结果不够稳定，差异较大。所以，到目前为止，尚未建立一种理想的ELISA抗体检测方法。

本研究利用HPS OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白，通过对最佳加样作用时间的确定和最佳酶标二抗反应时间等条件的探索优化，建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5（OMP P5）的间接ELISA抗体检测方法。为研究独立加样时间与酶标二抗时间对结果的影响，在用不同时间进行酶标二抗时仍对加样时间分别在15min～120 min范围内进行检测。反应结果显示，加样作用时间为15min，酶标二抗反应时间为15min，P／N值最高。所以，最佳加样作用时间和最佳酶标二抗反应时间均确定为15min。

用本研究建立的间接ELISA方法对研究所内饲养的未进行HPS免疫的健康猪和进行了HPS免疫的猪进行检测，前者检测血样中HPS均为阴性，后者检测血样中为HPS阳性高达95%，和实际免疫情况高度一致，检测时间亦大大缩短。在此基础上，进一步对某猪场的90份血清进行检测，该猪场送检的血清中阳性血清检出率高达81%，其中母猪的阳性率约为30%，仔猪阳性率高达90%。说明该猪场血样中仔猪HPS阳性率较高。可能是因为母猪分娩时为新生仔猪提供了很强母源免疫，仔猪体内的母源抗体通常可以维持到8周龄～12周龄。而且各猪场对于新生的仔猪都会有计划的进行易受感染菌的接种免疫。随母源抗体水平下降，仔猪仍然受到母源抗体一定程度的保护，此时会出现亚临床感染，仔猪自身的免疫应答反应将被激活，从而产生HPS抗体。有时哺乳仔猪群也会发病，尤其是免疫水平较低的青年母猪产下的仔猪。

本研究建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点，为副猪嗜血杆菌病的诊治提供了参考方法，也为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。

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