羟丙基-β-环糊精包合对右旋龙脑性质的影响*

苏健裕 陈建平 陈玲 李琳 朱良 徐振波

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

右旋龙脑(d-borneol)又名天然冰片、梅片，分子式为C10H18O.自古以来，右旋龙脑就是一种名贵的珍稀药材，在医药、化妆品、香料、食品工业上应用广泛［1-2］.中医认为，右旋龙脑具有去翳明目、开窍醒神、消肿止痛等功效［3］;现代药理表明，右旋龙脑具有促进血脑屏障开放、促进其他药物透过血脑屏障等作用［4］;因而，右旋龙脑在心脑血管疾病方面具有广阔的应用前景.但由于右旋龙脑水溶性差，且沸点较低，室温即升华，制备的成药在贮存期内极不稳定，从而严重影响了其功效的发挥［5］，应用范围受到很大的限制.

环糊精(CD)是由6个或6个以上的D-吡喃葡萄糖单元环状排列而成的一组低聚糖的总称，分子为略呈锥形的圆筒形，分子空腔的外侧为亲水性基团，内侧为疏水性基团，腔内有微弱的极性［6］.羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为环糊精的衍生物，常温下在水中的溶解程度一般超过50%，且在人体内基本上不被分解代谢，也不累积，非肠道给药时基本上全部随尿液排出体外，且可促使被包合物质迅速释放，表面活性和溶血活性低，使用更安全［7］.目前研究认为，难溶性药物与HP-β-CD形成包合物后，可显著改善药物的稳定性、溶解度和生物利用度等药剂学性质，因此，将药物制成包合物具有重要的临床意义［8］.鉴于 HP-β-CD 包合物具有增加药物稳定性、防止挥发、降低药物刺激性、增大药物溶解度等作用［5］，且目前国内对右旋龙脑/HP-β-CD 包合物的研究未见报道，文中将右旋龙脑与HP-β-CD制成包合物，并通过挥发性、热稳定性、抗光解性以及相溶解度实验考察右旋龙脑/HP-β-CD包合物的稳定性和溶解性，以期为右旋龙脑/HP-β-CD包合物在临床上的合理应用、给药方案的优化、药物剂型的改进以及质量控制等提供理论指导.

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

主要实验材料如下:右旋龙脑，纯度≥98%，广东嘉应制药股份有限公司产品;右旋龙脑对照品，纯度为99.9%，中国药品生物制品检定所产品，批号111688-200501;HP-β-CD，山东新大精细化工有限公司产品，食品级;无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯.

主要实验仪器如下:Agilent 6890N气相色谱仪，美国Agilent公司生产;Advantage真空冷冻干燥机，美国 VirTis公司生产;BS224S电子天平，德国Sartorius公司生产;DHG-9123电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产;GXZ智能光照培养箱，宁波东南仪器有限公司生产;DSCQ100差示热扫描量热仪(DSC)，美国TA公司生产;SB3200超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产;D8 ADVANCE X-射线衍射仪(XRD)，德国Bruker公司生产.

1.2 方法

1.2.1 右旋龙脑含量的测定

首先制作标准曲线.精密称取右旋龙脑对照品250mg置于50mL容量瓶中，加无水乙醇定容;分别吸取上述溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10mL容量瓶中，加无水乙醇定容;用微孔滤膜过滤，取1μL注入气相色谱仪中测定;以右旋龙脑浓度(x)为横坐标，右旋龙脑峰面积(y)为纵坐标，得线性回归方程 y=1307x+10.14，r2=0.9998.这表明在0.25～1.75mol/L范围内右旋龙脑的峰面积与其浓度的线性关系良好.

接着进行供试品溶液的制备.取包合物样品100mg，精密称定，置具塞离心管中，精密加入无水乙醇20mL，密塞，摇匀，超声处理30 min.2500 r/min下离心10min，吸取上清液，用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液.

然后进行精密度、重复性和加样回收率实验.精密度实验:精密吸取同一包合物供试品溶液1μL，连续进样5次，测定右旋龙脑的峰面积，计算得其相对标准偏差RSD=0.72%.重复性实验:精密称取同一包合物样品5份，制备供试品溶液，制样，测定右旋龙脑的峰面积，计算得其RSD=0.76%.加样回收率实验:取含右旋龙脑127.5mg/g的包合物样品5份，每份约100mg，精密称定，分别加入右旋龙脑对照品10mg，制备供试品溶液，制样，测定右旋龙脑的峰面积，计算得加样回收率为102.94%，RSD为 1.86%.

最后取1 μL供试品溶液注入气相色谱仪中进行测定，根据线性回归方程计算出包合物中右旋龙脑的含量(质量分数，余同).

色谱条件如下:色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细柱管(长30m，内径 0.25mm，膜厚约 0.25mm);氢火焰离子化检测器，检测温度为270℃;采用程序升温，柱温条件为100℃恒温1 min后，以10℃/min的速率升温至170℃，保持5 min;进样口温度为250℃;检测温度为270℃;载气为氮气，流速为7.8mL/min.

1.2.2 右旋龙脑包合物的制备

［9］制备右旋龙脑包合物.称取右旋龙脑0.589g溶于20mL无水乙醇中，即得右旋龙脑乙醇溶液.按照右旋龙脑与HP-β-CD 1∶6的质量比称取HP-β-CD 3.534g溶于100 mL 蒸馏水中，即得HP-β-CD水溶液.将右旋龙脑乙醇溶液缓慢滴入HP-β-CD水溶液中，40℃下超声60min.取出放入冰箱冷藏24h，真空抽滤，取滤液放入-20℃的冰箱中冻干后，再放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h，研碎，过80目筛得白色膨松状粉末包合物.根据如下包合物包合率的计算公式，得到实验制得的包合物的包合率为91.88%:

1.2.3 右旋龙脑包合物的鉴定

用差示扫描量热法和X-射线衍射法测试样品的形成.DSC测试条件:样品量为2～5 mg，气氛为氮气，流速为 40 mL/min，铝质坩埚，升温速率为10.0℃ /min，取右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物(与投料比一致)以及包合物各适量，按上述条件进行测试.XRD测试条件:Cu-Kα辐射，LynxExe阵列探测器，管电压40kV，管电流40 mA，扫描步长0.02°，扫描速度 17.7s/步，扫描范围 5°～55°.取右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物(与投料比一致)以及包合物各适量，根据上述条件进行测试.

1.2.4 右旋龙脑包合物的稳定性测试

挥发性实验参照文献［5］进行.分别称取2 g右旋龙脑包合物以及右旋龙脑与HP-β-CD的物理混合物(按右旋龙脑与HP-β-CD质量比1∶6混合)于培养皿中，于25℃恒温干燥箱中放置5 d，分别于第0、1、2、3、4、5d 时取样，按制作标准曲线的方法测定包合物中的右旋龙脑含量.

热稳定性实验参照文献［5，10］进行.分别称取2g右旋龙脑包合物以及右旋龙脑与β-环糊精的物理混合物(按右旋龙脑与 HP-β-CD质量比1∶6混合)于培养皿中，分别在37和60℃恒温干燥箱内放置5d，于第 0、1、2、3、4、5d 时取样，按照制作标准曲线的方法测定右旋龙脑含量.

抗光解性实验参照文献［5，10］进行.分别称取2g右旋龙脑包合物以及右旋龙脑与β-环糊精的物理混合物(按右旋龙脑与 HP-β-CD质量比1∶6混合)于培养皿中，放进光照培养箱内，在光照强度3000lx 的条件下放置 5 d，分别于第 0、1、2、3、4、5 d时取样，按照制作标准曲线的方法测定右旋龙脑含量.

1.2.5 右旋龙脑/HP-β-CD包合物的相溶解度测定

右旋龙脑/HP-β-CD包合物的相溶解度测定参照文献［11］进行.取右旋龙脑20 mg溶于适量无水乙醇中，分别加入浓度为 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18mol/L的 HP-β-CD溶液 20 mL，在超声温度为40℃条件下超声60 min，放入 -4℃冰箱中冷藏24h，过滤，取滤液在-20℃下冻干后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，精密称定所得包合物的质量，再取包合物适量，采用气相色谱法按制作标准曲线的方法测定包合物中右旋龙脑的含量.以右旋龙脑的浓度对HP-β-CD的浓度作图，得到相溶解度曲线.

2 结果与分析

2.1 右旋龙脑/HP-β-CD包合物的鉴定

2.1.1 DSC 分析

右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物和包合物的DSC曲线如图1所示.从图1中可以看出:HP-β-CD大约在90.02℃处出现一个宽的吸收峰，表明其是非晶态物质，该峰可能是由于HP-β-CD分子间脱水所形成的吸收峰［12-13］;物理混合物在90.11℃也出现相似的HP-β-CD的宽吸收峰，说明物理混合物中HP-β-CD的晶型和熔点没有发生改变，同时，在约72.17℃处出现跟右旋龙脑图谱相近的吸收峰，表明物理混合物的吸收峰实际上是右旋龙脑和HP-β-CD吸收峰的叠加;而在包合物中却表现出了不同的峰型，HP-β-CD在90.02℃处的吸收峰被削弱，出现在74.29℃处，原因可能是右旋龙脑与HP-β-CD形成了很强的分子间作用力.右旋龙脑的吸收峰在包合物中并没有出现，原因可能是右旋龙脑的吸收峰被HP-β-CD屏蔽，这表明右旋龙脑已经包含在HP-β-CD空腔中，即包合物已形成.

图1 右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物和包合物的DSC曲线Fig.1 DSC curves of d-borneol，HP-β-CD，as well as physical mixture and inclusion complex of d-borneol and HP-β-CD

2.1.2 XRD 分析

图2 右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物和包合物的XRD谱图Fig.2 XRD patterns of d-borneol，HP-β-CD，as well as physical mixture and inclusion complex of d-borneol and HP-β-CD

右旋龙脑、HP-β-CD、两者的物理混合物和包合物的XRD谱图如图2所示.由XRD谱图可以看出:右旋龙脑在 2θ=7.63°，8.53°，15.28°，17.66°，30.75°处出现衍射峰，表明右旋龙脑是一种结晶态物质;而 HP-β-CD 在2θ为 5°～15°和 15°～25°处出现两个宽的衍射峰，表明HP-β-CD是一种非晶态物质;在混合物的衍射图中可以看出有右旋龙脑和HP-β-CD衍射峰的存在，这说明物理混合物的衍射峰为右旋龙脑和HP-β-CD衍射峰的叠加，可见，右旋龙脑与HP-β-CD直接混合后，其晶型没有改变，仍保持各自的晶型特点;包合物的谱图则不再是两者的简单叠加，其在5°～15°和15°～25°处表现出跟HP-β-CD类似的两个宽的衍射峰带，而右旋龙脑原来的衍射峰在包合物中消失或减弱，证明右旋龙脑与HP-β-CD形成了包合物，且晶型发生了显著变化，同时也表明包合物的形成不是简单的物理混合，而是形成了一种新的物相.

2.2 包合物的稳定性分析

2.2.1 挥发性

图3所示为包合物的挥发性实验结果.由图3可以看出:包合物和混合物在25℃下放置5d后，右旋龙脑的挥发率分别为0.42%和15.98%，可见右旋龙脑被包合后，在常温下其挥发性得到了明显的抑制，远远低于单纯的右旋龙脑.

图3 包合物和混合物在25℃下的挥发性结果Fig.3 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 25℃

2.2.2 热稳定性

图4给出了包合物的热稳定性实验结果.由图4可以看出:包合物和混合物在37℃下放置5 d后，其挥发率分别为6.94%和22.89%;60℃下放置5 d后，则分别达到24.29%和60.68%;说明混合物中右旋龙脑的挥发速率明显快于包合物中.随着温度的升高，包合物的挥发率和挥发速率均增大，这说明右旋龙脑被β-环糊精包合之后，包合物的热稳定性虽然有所增加，但过高的温度依然不利于右旋龙脑包合物的储存.实验结果表明，在一定的温度范围内，右旋龙脑被包合后，其热稳定性显著增强.

图4 包合物和混合物在37和60℃下的挥发性结果Fig.4 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 37 and 60℃

2.2.3 抗光解性

图5给出了包合物的抗光解性实验结果.由图5可以看出，在3000lx下放置5d后，包合物和混合物的挥发率分别为16.06%和52.29%，且混合物中的右旋龙脑挥发速率明显比包合物快.实验结果表明，右旋龙脑制成包合物之后，其抗光解性明显增强.

图5 包合物和混合物在3000lx下的挥发性结果Fig.5 Results of volatility tests of inclusion complex and mixture at 3000lx

2.3 右旋龙脑/HP-β-CD包合物的相溶解度分析

图6所示为包合物的相溶解度图.从图6可以看出，随着HP-β-CD浓度的增加，右旋龙脑在水中的浓度也增加，当HP-β-CD浓度高于8mol/L时，右旋龙脑的浓度不再明显增加，原因可能是HP-β-CD的浓度已达到足以包合全部投入的右旋龙脑的程度［11］.根据 Higuchi等［14］提出的原理，该相溶解度曲线符合AL型，即HP-β-CD和右旋龙脑形成了1∶1的包合物.对HP-β-CD在0～8 mol/L浓度范围内做拟合曲线，得到线性方程为:Y=0.6566X+0.0140，r2=0.9959.包合物的包合常数可按照公式K=k/S0(1-k)［15］来计算(S0为包合物的起始浓度，k为斜率)，得到包合常数K为136.58 L/mol，表明右旋龙脑与 HP-β-CD之间形成了很强的分子间作用力［16］，右旋龙脑已经与 HP-β-CD 形成了包合物，且右旋龙脑被包合后，相比右旋龙脑的固有溶解度(0.014mol/L)，溶解性提高了近 376.2 倍.

图6 右旋龙脑/HP-β-CD包合物的相溶解度曲线Fig.6 Phase solubility curve of d-borneol/HP-β-CD inclusion complex

3 结语

环糊精包合法可以提高难溶性药物的溶解度，目前国内外已经有一些关于环糊精包合难溶性药物的报道，包合后的难溶性药物水溶性及稳定性等均有不同程度的提高.已有研究表明，HP-β-CD作为一种环糊精衍生物，在水溶性及稳定性上优于环糊精，更适合作包合材料.文中采用最佳的HP-β-CD包合右旋龙脑的工艺，即采用40℃下超声60 min(相关数据将另文发表)制得包合物，并通过DSC和XRD进行了验证.经过挥发性、热稳定性和抗光解性实验证实了右旋龙脑经HP-β-CD包合后，稳定性得到了明显的提高.这不仅能较大程度上延长右旋龙脑制备成成药之后的贮存时间，并且也有助于药效的发挥.相溶解度实验表明，右旋龙脑被包合后，溶解性得到了明显的提高.因此，采用HP-β-CD增溶可以解决右旋龙脑制剂研发、生产、应用中的许多难题.

参考文献:

［1］李毓敬，朱良锋，陆碧瑶，等.天然右旋龙脑新资源——梅片树的研究 ［J］.植物学报，1987，29(5):527-531.Li Yu-jing，Zhu Liang-feng，Lu Bi-yao，et al.Studies on Mei Pian Shu(Ciinamomum Burmannii physiological type)as a new resource of natural d-borneol［J］.Acta Botanica Sinica，1987，29(5):527-531.

［2］罗忠生，龙光远，彭招兰，等.天然右旋龙脑加工技术的研究 ［J］.江西林业科技，2003，1:11-12.Luo Zhong-sheng，Long Guang-yuan，Peng Zhao-lan，et al.Natural d-borneol’s processing technique ［J］.Jiangxi Forestry Science and Technology，2003，1:11-12.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:56.

［4］杨洪滨，李志坚，于楠楠，等.冰片对血眼屏障通透性的影响 ［J］.国际眼科杂志，2008，8(8):1576-1578.Yang Hong-bin，Li Zhi-jian，Yu Nan-nan，et al.Effect of borneol in improving permeability of blood-ocular barrier［J］.International Journal of Ophthalmology，2008，8(8):1576-1578.

［5］秦冬彦，宋洪涛，郭涛，等.冰片 β-环糊精包合物的稳定性考察［J］.中草药，2000，31(4):255-257.Qin Dong-yan，Song Hong-tao，Guo Tao，et al.Studies on the stability of borneol-β-cyclodextrin inclusion complex［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2000，31(4):255-257.

［6］张莉，罗来辉.环糊精包合物的研究进展［J］.华北工学院学报，2003，24(4):278-281.Zhang Li，Luo Lai-hui.Research progress of cyclodextrin inclusion complexes［J］.Journal of North China Institute of Technology，2003，24(4):278-281.

［7］李志英，刘丽琼，张海容.相溶解度法研究羟丙基-β-环糊精对肉桂酸的增溶作用［J］.分子科学学报，2010，26(4):294-296.Li Zhi-ying，Liu Li-qiong，Zhang Hai-rong.Study on the enhancing solubility of hydroxycinnami in hydroxypropy-βcyclodextrin by phase solubility method ［J］.Journal of Molecular Science，2010，26(4):294-296.

［8］李荣誉，汪德刚.布洛芬-β-环糊精包合物的溶解度及溶出度测定［J］.中国兽医杂志，2003，39(10):36-37.Li Rong-yu，Wang De-gang.Study on the solubility and dissolution rate of ibuprofen-β-cyclodextrin inclusion complexes［J］.Chinese Journal of Veterinry Medicine，2003，39(10):36-37.

［9］张玮，龚金红，张学农.冰片-β-环糊精包合物的制备及鉴定［J］.中成药，2008，30(9):1391-1394.Zhang Wei，Gong Jin-hong，Zhang Xue-nong.Preparation and identification borneol-β-cyclodextrin inclusion complex［J］.Chinese Traditional Patent Medicine，2008，30(9):1391-1394.

［10］罗媛，郑林，兰燕宇，等.菊黄上清含片中冰片β-环糊精包合物的制备工艺［J］.贵阳医学院学报，2010，35(2):137-139.Luo Yuan，Zheng Lin，Lan Yan-yu，et al.Study on preparation technologyofborneol-β-cyclodextrin inclusion complex in Juhuangshangqing buccal tablet［J］.Journal of GuiYang Medicine College，2010，35(2):137-139.

［11］王靖，张铁军，廖茂梁，等.冰片-羟丙基-β-环糊精包合物的研究［J］.天津中医药，2007，24(2):150-152.Wang Jing，Zhang Tie-jun，Liao Mao-liang，et al.Study on the inclusion complex of borneol with hydroxypropylβ-cyclodextrin ［J］.Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine，2007，24(2):150-152.

［12］Marini A，Berbenni V，Bruni G，et al.Dehydration of βcyclodextrin:facts and opinions［J］.Thermochim Acta，1996，279:27-33.

［13］Kohata S，Jyodoi K，Ohyoshi A.Themal decomposition of cyclodextrin(a，b，c，and modified β-CD and metal-β-CD)complexes in the solid phase［J］.Thermochim Acta，1993，217:187-198.

［14］Higuchi T，Connors K.Phase-solubility techniques［J］.Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation，1965，4:117-212.

［15］Jun S W，Kim M S，Kim J S，et al.Preparation and characterization of simvastatin/hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent(SAS)process［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2007，66(3):413-421.

［16］Wang J，Cao Y P，Sun B G，et al.Characterisation of inclusion complex of trans-ferulic acid and hydroxypropylβ-cyclodextrin ［J］.Food Chemistry，2011，124(3):1069-1075.