耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染监测及同源性分析

吴晓红，王 震，施 瑜，曹珍娣，印夏薇

（镇江市第二人民医院检验科1、感染管理科2，江苏 镇江 212002）

近年来,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染日趋严重。MRSA呈多重耐药表型[1-2]，因此，对MRSA的临床分布情况和耐药性进行监测，并寻找导致MRSA院内感染的途径，对控制MRSA院内感染，规范合理地使用抗生素有重要的指导意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2005年2月至2010年3月从我院临床标本中（包括痰、咽拭子、尿液、血液、胸水、腹水、胆汁、伤口分泌物、脓液、静脉导管等）分离出的金黄色葡萄球菌85株，去除同一患者重复分离菌株；从医护人员手、床单、床头柜和医疗器械等院感监测标本中分离出的金黄色葡萄球菌32株，共计117株。

1.2 方法 当临床实验室检测出MRSA菌株后，即刻通知院感人员到病房做多点采样。细菌的分离培养及鉴定按《全国临床检验操作规程》第3版操作。药敏试验采用K-B法进行，结果的判读按美国国家临床实验室标准化委员会（CLSI）2008年标准进行，用WHONET 5.3软件分析。

1.3 MRSA的检测 M-H琼脂中加入2%Na-Cl，121℃20 min高压灭菌后，在9 cm平皿中浇25 ml琼脂，制成4 mm厚培养基，贴30 μg/片的头孢西丁（FOX）纸片，35℃，24 h。抑菌圈直径≤19 mm判为MRSA。质控菌株：金葡菌ATCC 25923，由浙江杭州天和微生物试剂公司提供。MRSA阳性对照菌株（JS0405）由江苏省临床检验中心程梅老师提供。确诊方法采用多重PCR方法，以nuc基因和mecA基因合成两对引物，在279 bp和310 bp处出现扩增条带表示MRSA。具体方法见文献[3]。

1.4 重复一致序列(ERIC)-PCR 选择肠道菌广泛存在菌体DNA中的重复序列ERIC-2(5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3')作 为 引 物[4]。ERIC-PCR 扩增体系：10×Buffer 2.5 μl、MgCl2(2.5 mmol/L)2.5 μl、dNTP(0.2 mmol/L)2.0 μ l、Taq Polymerase 2 U、引物各25 pmol、模板DNA(煮沸法制备)3 μl，添加灭菌去离子水至 25 μl；扩增条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1 min，退火35℃ 1 min，延伸72℃2 min，48个循环，最后72℃延伸10 min。产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，在紫外线下观察。

1.5 统计学处理 用SPSS10.0软件进行统计分析。各组耐药率的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SA、MRSA临床分布情况 共检出SA 117株，其中临床标本中检出SA 85株，院感标本中检出SA 32株。MRSA检出率为63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液样本中分离率最高(25.7%)，其次是伤口分泌物、脓液(17.6%)和尿液标本(14.9%)。各类院感标本中MRSA都有不同程度检出，以医护人员手、物体表面(床单、床头桂、把手)、医疗器械等为主，见表1。

表1 SA、MRSA在临床标本及院感监测标本中的分布

2.2 MSSA、MRSA对16种抗生素的耐药性比较 MRSA对常用抗菌药物有较高的耐药率，如氨苄西林(100%)、红霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、诺氟沙星(82.4%)、环丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四环素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、复方新诺明(39.2%)、米诺环素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹罗星(2.7%)，万古霉素、替考拉宁的敏感性为100.0%。MRSA的耐药率高于MSSA，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 MSSA、MRSA对16种抗生素的耐药率

2.3 ERIC-PCR分型 74株MRSA均能扩增出清晰的DNA指纹图谱，扩增出的条带为3～9条，大小为200～1500 bp。根据扩增片段数目、大小不同，将74株MRSA分成8个型，图1中条带1、2分别来源于泌尿外科住院患者尿液标本和膀胱造瘘管排尿口；条带3、4分别来源于普外科住院患者伤口脓液标本和床单；条带5、6、7分别来源于呼吸内科不同住院患者的痰液和呼吸机管道。结果表明同型菌株多来源于同一病房。医护人员手、床单和医疗器械等导致的交叉感染，是引起MRSA医院内传播的主要原因。

图1 ERIC-PCR分型结果

3 讨 论

本次研究对金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药性进行统计分析，并采用多重PCR检测mecA基因的携带情况，比较耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)的耐药率，同时采用肠杆菌科基因间重复一致序列(ERIC)-PCR方法对MRSA做同源性分析。结果共检出SA 117株，其中临床标本中检出SA 85株，院感标本中检出SA 32株。MRSA检出率为63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸内科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液样本中分离率最高(25.7%)，其次是伤口分泌物、脓液(17.6%)和尿液标本(14.9%)。各类院感标本中MRSA都有不同程度检出，以医护人员手、物体表面(床单、床头桂、把手)、医疗器械等为主。MRSA对常用抗菌药物有较高的耐药率，如氨苄西林(100%)、红霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、诺氟沙星(82.4%)、环丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四环素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、复方新诺明(39.2%)、米诺环素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹罗星(2.7%)，万古霉素、替考拉宁的敏感性为100.0%。MRSA耐药率高于MSSA，差异有统计学意义(P＜0.05)。通过ERIC-PCR分型，将74株MRSA分成8个型，结果表明同型菌株多来源于同一病房。通过本次研究，发现医护人员手、床单和医疗器械等导致的交叉感染是引起MRSA医院内传播的主要原因。可通过以下几个方面的工作，减少MRSA的院内感染率。

MRSA的主要耐药机制是由染色体介导产生特异性低亲和力的青霉素结合蛋白PBP2a，mecA基因是PBP2a的编码基因，是MRSA的主要耐药因子[5]。MRSA除携带mecA基因外，还有多种其他耐药基因，因此MRSA表现为多重耐药表型[6]。由MRSA引起的院内交叉感染常难以控制[7]。因此，应该在抗生素使用前留取标本做细菌学检查并对病原菌作药敏试验，选择合适抗生素治疗，并尽量选用一、二代抗生素，从而有效避免MRSA产生。

由医务人员及病员家属的手导致的医院感染不容忽视。落实正确的洗手方法并一贯坚持是非常关键的[1]。在接触患者前、后以及患者的排泄物后都应该认真彻底的洗手。另外，用快速消毒剂作手部清洗也是一个很好的方法。

与患者接触的所有设备及仪器应每日消毒，并定期做细菌学监测。椅、桌面、地面用含氯消毒剂消毒，不同病室的拖把不能混用，被污染的器材和物品应消毒后再清洗、灭菌。

实施隔离措施是切断传播途径的有效措施。对已经确诊为MRSA感染患者应在床头作醒目表识，并要求隔离治疗。MRSA感染者使用过的物品要先消毒后再清洗。污染物用黄色垃圾袋盛装,作焚烧处理。

[1]阎红霞,殷小基,郭发良.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染分析与预防措施[J].临床医学,2006,26(11)：2-3.

[2]刘惠容,林定忠.临床标本耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分布及药敏分析[J].中国当代医药,2011,18(10)：70-71.

[3]吴晓红,王 震.多重PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[J].疑难病杂志,2010,9(11)：851-853.

[4]王 震,周丽萍,庄建伟,等.大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌耐药基因分析[J].中国公共卫生,2008,24(7)：818-820.

[5]罗少峰,彭少华,顾 剑.湖北地区金黄色葡萄球菌耐药性变迁[J].中华医院感染学杂志,2007,17(8)：997.

[6]陈 剑,余方有,王彩虹.耐复方新诺明金黄色葡萄球菌耐药谱分析[J].中华医院感染学杂志,2008,18(10)：1482-1484.

[7]樊剑锋,杨永弘,马 琳.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗生素耐药和耐药基因的检测[J].首都医科大学学报,2005,26(5)：540-544.