油菜籽油酸合成相关基因研究进展

张浩文，唐志东，谭勇俊，刘忠松

(湖南农业大学农学院，长沙410128)

提高油酸含量是油菜品质育种的重要目标［1］。脂肪酸合成途径目前已有较深入的研究［2，3］，植物种子中脂肪酸合成途径如图1。在植物种子中油酸是脂肪酸合成途径中的一个中间产物，其合成不仅涉及到脂肪酸生物合成途径中一系列的酶促反应，还与ACP(酰基载体蛋白)的缩合反应和ACP硫酯酶、ACS(酰基辅酶A合成酶)有关。种子中脂肪酸合成有关的主要场所有两个:质体和内质网。

在质体中，乙酰辅酶A经过了一系列的羧化和缩合生成16:0ACP。该物质在β－酮酯酰－ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)作用下生成18:0ACP。18:0ACP在硬脂酸脱氢酶(FAB2)作用下生成18:1Δ9 ACP。18:0ACP、18:1Δ9 ACP在更倾向不饱和 ACP的ACP硫酯酶A(FAT A)作用下水解成游离脂肪酸并通过ACS转化成相应的COA运到内质网中;16:0ACP在更倾向于饱和ACP的ACP硫酯酶B(FAT B)作用下水解成游离脂肪酸并通过ACS转化成16:0 COA运到内质网中。在内质网中18:0COA可以一直延伸为24:0 COA;18:1ACP通过甘油二酯途径生成油酰磷脂(18:1Δ9 ACP)，此物质为生成油酸的前体。有两个酶促反应都以此物质为底物，其中由脂肪酸延长酶(FAE)控制生成芥酸的反应更具竞争优势，在双低油菜中该反应被截断;另一个反应是在内质网油酸脱氢酶(FAD2)控制下生成亚油酸，该反应是影响双低油菜油酸含量的最主要反应。内质网中的COA和PC都能进入TAG(三酰甘油)途径生成油脂。

从脂肪酸合成途径看，影响种子中油酸合成的基因较多。在质体中主要有 KASⅡ，FAB2，FAT，ACS;影响油酸积累的是FAD2和FAE1基因。

图1 油菜种子内油酸合成示意图(改编自杨燕宇［4］)

1 与油酸合成有关的基因

KASⅡ是编码16:0 ACP到18:0 ACP的酰基蛋白合成基因，在拟南芥叶肉细胞中69%的16:0ACP转化由KASⅡ控制［5］。在油菜中很早就有有关分离和克隆KAS基因家族CDNA的报道［6］。在E.coli中KAS酶的晶体结构已经测定［7］，油菜中只确定了KASⅢ和 KASⅠ酶的晶体结构［8］。拟南芥中，用基因干扰降低KASⅡ的表达水平，能使硬脂酸比例提高，油酸比例减少，通过RNA干扰KASⅡ，16:ACP的浓度是野生型的 7倍［9］。萼距花 (Cuphea wrightii)的KASⅡcDNA在拟南芥中表达，主要是增加了短碳链ACP(C10:0和C12:0)的量，而中碳链 ACP(C14:0 和 C16:0)的量减少［10］。KASⅡ原核表达的结果不尽相同，在棕榈(Jessenia bataua)中获得的KASⅡcDNA，通过融合蛋白的形式在拟南芥中表达，提高了花生烯酸和芥酸的含量，而且KASⅡ基因不能完成棕榈酸到硬脂酸的生化过程，所以棕榈的KASⅡ基因可能是脂肪酸延长途径的一个候选基因。于此相反，Jha［11］利用在芥菜型油菜中表达巴西固氮螺菌的酰基载体蛋白(KASⅡ)，提高了种子中油酸的含量，并提高了油酸、亚油酸和亚麻酸之间的比值，降低了芥酸含量。通过蛋白定位发现棕榈的KASⅡ作用位置可能在微粒体(推测为内质网)，而不同于以往的质体，可能是造成此差异的原因。Hakozaki［12］在拟南芥中利用T－DNA插入突变产生的AtKAS2(KASⅡ)基因突变体，RTPCR结果表明AtKAS2基因在许多器官中表达，在角果中有高表达，而GUS实验表明，该基因的启动子在大量器官中都表达;基因型和表现型的结果表明该基因在胚胎发育中是个必须基因，缺陷体纯合子将在小球期到心型期死亡。

FAB2是编码18:0 ACP至18:1Δ9 ACP的 Δ9脱氢酶的脱氢酶基因。在大豆中，通过抑制FAB2基因，可以增加硬脂酸的脂肪酸含量，而且FAB2基因也有一定的时空特异性［13］。Kachroo［14］对 FAB2的突变体做了研究，发现在拟南芥中还存在4个FAB2的等位基因，但这些基因在种子中的特异性表达不如FAB2，在突变体无法完全代偿FAB2缺陷突变体功能，突变体油酸含量偏低;通过这4个等位基因的研究，证明油酸的水平是在转录和翻译后水平调控的。

FAT是ACP转变为相应的游离脂肪酸重要水解酶，FAT B主要负责水解饱和ACP，FAT A主要负责水解不饱和ACP。Li［15］通过连锁和关联分析相结合的方法，在玉米中解析了一个C16:0的QTL(数量性状基因座)，在QTL区域得到了一个候选基因fatb，该基因编码ACP硫酯酶。该研究还发现通过该基因最后一个外显子区域11 bp碱基的插入能降低脂肪酸中C16:0的含量，达到饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的最优比例。Moreno － Pérez［16］发现拟南芥FAT A基因敲除的突变体的成熟种子油酸含量比正常体要低，干种子中三酰甘油的量有所降低。

ACS是编码在内质体内膜将游离脂肪酸转化为酰基COA的基因。de Azevedo Souza［17］发现拟南芥中一个新的ACS合成基因，该基因突变体没有花粉且自交不结实，推测该基因影响花粉小孢子的形成。通过反射性基因芯片检测，该基因编码合成的酰基蛋白复合体在体外的活性，发现该蛋白的活性与油酸基质密切相关。

FAD3是编码亚油酸向亚麻酸转化的基因。FAD3能控制亚油酸向亚麻酸转化，低亚麻酸性状可以整合到高油酸油菜中，但不可以增加油酸含量［18］。

综上所述，上面的基因与脂肪酸的组成有一定的关系。其中，KASⅡ，FAB2，FAT与油酸的含量关系较为密切。抑制FAD3可以达到降低亚麻酸含量的目的，可以在高油酸育种中进行遗传整合。而现阶段为了提高油酸含量应主要从FAD2和FAE两个基因着手。

2 影响油酸积累的基因

2.1 FAD2基因

转基因研究证明，通过抑制FAD2基因表达，能显著提高种子内油酸含量。Bao等［19］通过RNAi干扰FAD2基因获得了6株转基因油菜，在转基因油菜的第三代RT－PCR检测FAD2基因表达显著下调，油酸含量由40%上升为72.9%。Peng［20］等构建了RNAis双元干扰载体，同时沉默FAD2基因和FAE1基因得到了油酸85%以上，其他多元不饱和脂肪酸在10%以下，与遗传背景差别大的GX品系杂交得到的子代的脂肪酸含量能稳定遗传。

FAD2基因的拷贝数和拷贝具体的位置在油菜中尚不明确，目前主要是通过定位同源基因所在BAC的位置的方法。Jung等［21］在白菜型油菜中通过全基因组扫描白菜EST数据库获得了两个FAD2拷贝，BrFAD2－1和 BrFAD2－2，分别位于KBrB063G23和 KBrH113N10两个 BAC。其中BrFAD2－2在白菜型油菜中产生了一个终止子的突变而造成在白菜型油菜中不表达，他通过实验证实BrFAD2－1是一个有功能的拷贝。Scheffler等［22］利用Southern杂交发现在甘蓝型油菜中FAD2基因有4～6个拷贝，其中4个拷贝被分别定位在同源的A1 和 C1、A5 和 C5 连锁群。Smooker［23］用 DH 群体构建遗传图谱，通过与脂肪酸合成相关的基因所在白菜BAC，设计与脂肪酸合成相关的拟南芥同源标记并将它们定位在连锁图上，其中3个FAD2候选基因分别定位于 A1、C1、A5、C5，其中 C1的 FAD2同源标记落在油酸QTL(数量性状基因座)置信区间内，C5的 FAD2同源标记是根据 BAC KBrB063G23设计。杨燕宇等［24］通过高油酸品系HOP和湘油15构建F2无芥酸群体进行油酸QTL定位，在遗传背景上排除了芥酸的干扰，用单株法和半粒法都发现了两个跟油酸相关的QTL，分别在A5和C5上。A5上QTL与FAD2基因紧密连锁(来源于白菜的 FAD2 BAC KBrB063G23)，与 C5上 QTL区域紧密连锁的标记 BRP06Y06－a(BAC KBrB087P06)在A5 QTL区域有同源标记，因此推测这两个QTL分别对应两个相应的FAD2。Hu等［25］通过拟南芥中的FAD2同源标记［26］，在甘蓝型油菜高油酸亲本和低油酸亲本中分别扩增得到FAD2基因克隆并测序设计特异基因标记。随后将FAD2基因标记定位在了连锁图上，其中A5上的基因标记落在了油酸主效QTL的置信区间内，还在C1上定位了一个较小的QTL。Jagannath等［27］将基因特异标记 FAD2－1(设计自 B.rapa，定位 A基因组FAD2)，FAD2－2(设计自B.nigra，定位B基因组FAD2)分别定位在芥菜型油菜遗传图谱中的A5和B1连锁群，可惜油酸的QTL并未定位在FAD2基因标记所在连锁群。FAD2拷贝能够分为种子特异表达和在植物中多个组织表达两种，而且可能存在假基因。肖钢等［28］通过对甘蓝型油菜FAD2 PCR克隆产物测序的方式，得到了11个不同的FAD2拷贝，6个拷贝在编码区域出现终止密码子，另外5个的同源性为90.6%～99.74%。11个拷贝通过同源性不同分为两组，命名为FAD2Ⅰ和FAD2Ⅱ。RT－PCR结果表明在授粉后27 d的种子中FAD2Ⅰ表达，FAD2Ⅱ不表达。在叶片中两者都表达。肖钢等［29］将上述6个出现终止密码子的FAD2拷贝进行了酵母表达实验，证实这6个拷贝没有改变酵母脂肪酸组成，推测这6个拷贝为假基因。

表1 不同作物的FAD2拷贝情况

根据上述文献，笔者认为在芥酸合成途径受阻的前提下，FAD2基因是影响油酸的关键基因，并且在3种油菜中的FAD2都存在多拷贝，并且在克隆FAD2中可能会遇到假基因。其中白菜型油菜证实存在1个FAD2拷贝指向A5，甘蓝型油菜有4～6个FAD2拷贝，其中A5上确定有一个有功能的FAD2，而在C5、A1、C1上存在FAD2基因，可没有相关功能的报道。在芥菜型油菜中A5、B1上也可能分别有一个FAD2拷贝。

油菜中FAD2的拷贝数和拷贝分布都不是很明确，这对提高油酸含量和进一步分析脂肪酸合成调控造成了困难。但模式植物拟南芥和其他油料作物的FAD2序列信息和功能研究为研究油菜的FAD2基因提供了良好的资料。而近期白菜的测序完成［30］和甘蓝物理图谱的构建［31］，为我们提供了更多的信息。在脂肪酸去饱和中研究较深入的有拟南芥、玉米、大豆、棉花、芝麻等作物。

如表1所示，可以看出FAD2拷贝的作用模式可能为1～2个在种子中特异表达的拷贝在油酸向亚油酸转变的过程中起主要作用，其他拷贝在全部组织中低表达。不同拷贝可能受温度影响大小不一。不同物种FAD2不一样，例如红花FAD2的热稳定性要比向日葵高［32］。拷贝间差异主要集中在3'和5'非编码区。相比这些作物，我们只知道在油菜中A5上有一个有确定功能的FAD2，即在种子中特异表达的拷贝。其他拷贝在油菜中的位置尚不太清楚，具体的拷贝数未确定，其他拷贝对油酸含量的影响效果和在不同环境下的表达效果都不甚清楚。因此，首先要确定FAD2基因各拷贝在染色体中的具体位置，然后分析这些拷贝的主要功能和结构。FAD2基因的非编码区、启动子以及FAD2逆境表达是油菜今后研究的重点。

2.2 FAE1基因

FAE1(芥酸合成酶)在非双低油菜中是影响油酸的主要基因［4］。近十年来，FAE1基因在区分不同拷贝，和在序列水平上分析基因功能上取得了一定的进展。众多的研究表明，在甘蓝型油菜中芥酸的QTL 是定位在 A8 和 C3 上［43～45］，分别对应两个FAE1的拷贝 FAE1.1和 FAE1.2。Gupta等［45］从芥菜型高芥酸油菜和低芥酸油菜中分离出两个拷贝FAE1.1、FAE1.2，发现高芥酸和低芥酸品种之间存在4个SNP位点，FAE1.2存在3个SNP。中国发现了不同于以往ORO(德国低芥酸种质)的新双低种质资源中双9号。Wu等［46］通过FAE1亚型(缺失4对碱基)酵母表达和转基因油菜证实中双9号是由于FAE1基因的4对碱基缺失导致移码，翻译提前终止造成的，这种现象主要出现在C基因组。徐爱遐等［47］利用同源序列法对6个芥菜型油菜品种(高芥酸、中芥酸、低芥酸)、2份白菜型油菜品种(高芥酸和低芥酸)和1份黑芥品种的FAE1基因进行克隆和测序，得到9个品种的FAE1基因编码区全长均为1 522 bp，不含内含子，均编码507个氨基酸残基。芥菜型油菜中有两种FAE1基因序列(BjFAE1.1和BjFAE1.2)，其亲缘种白菜型油菜和黑芥各有一种FAE1基因序列(BrFAE1和BnFAE1)，分别对应芥菜中的 BjFAE1.1和BjFAE1.2 。Wang［48］用 Ecotilling 技术检测白菜型油菜、甘蓝、甘蓝型油菜，找到了一个导致FAE1基因功能丧失的SNP位点，还发现编码FAE1的编码序列有18个SNP可以区分A、C基因组。比较不同芥酸含量油菜的 FAE1基因序列，BjFAE1.1和BjFAE1.2都存在两个SNP。

3 新技术和新方法对研究控制油酸基因的启示

脂肪酸含量是一个数量性状，这使得它的研究具有一定的复杂性，但现代生物信息学的发展和分子生物学的进步对挖掘数量性状下隐藏的基因，提供了条件。

电子克隆和电子定位通过利用大量的EST等数据，缩小了实验范围，使得实验的速度大大加快。在大豆中，Sharma［49］利用比较拟南芥、甘蓝型油菜、蓖麻子、大豆中261个脂肪酸合成、油脂合成相关的基因得到了一张电子表达谱，该电子表达谱显示一些脂肪酸代谢重要基因(如FAD2)有异常的分离。Chi［50］通过电子克隆的方法分离了大豆中29个减饱和基因，并将他们在染色体中的分布进行了预计。我国的玉米研究领域在脂肪酸［51］和株高［52］方面，也做了一些类似的研究，获得了一些表达谱和候选基因。

利用EST序列拼接能发现新的基因。Schlueter［39］利用大豆的EST序列发现了两个新的FAD2基因，并证实其中FAD2－c是控制低温下亚油酸合成的FAD2基因。Jung等［21］通过扫描白菜型油菜EST序列库分离出了BrFAD2－1基因。

另外，我们可以通过挖掘高密度图谱下已定位的QTL，来获得一些相关基因。方法有关联分析结合连锁分析［15］、功能标记解析［53，54］，通过这些方法能够将数量性状和基因关联起来，从而发现和克隆更多脂肪酸相关基因。研究QTL区域中的候选基因，利用近等基因系在不同环境下的表现，采取blot hybidization(印迹杂交)结合 RT －PCR［55］或者基因芯片技术［56］能够更深入了解QTL区域中各个基因的代谢调节以及基因与环境的互作。

在高油酸油菜的育种方面还应注意利用大规模回交育种，构建油菜高油酸的导入系群体，利用导入系能更为灵敏地发现一些微效QTL。黎志康［57］曾对水稻的分子育种体系的建立做了综述，后来他在利用水稻回交导入系研究耐盐［58］、抗旱［59］、抗纹枯病［60］QTL等取得了一定进展。总之，如何利用现有的生物学信息数据库，提高检测QTL灵敏度，并进一步挖掘QTL中影响性状的基因是研究像油酸含量这类性状一个值得思考的问题。

4 展望

提高油酸含量是油菜品质育种的重要目标。通过抑制FAD2基因可以获得油酸含量80%的油菜。油菜脂肪酸合成网络很复杂，想通过抑制FAD2基因以获得85% 以上油酸含量的油菜很困难。一方面，可能是FAD2基因在许多物种中为多拷贝，要想完全抑制FAD2有一定的难度。更重要的一方面，生物是一个系统，就FAD2基因来说还有许多别的功能。Zhang［61］证实FAD2的功能在拟南芥的早期萌发和生长中是有作用的。因此一味的抑制FAD2表达可能不利于种子萌芽及植株的整体生长。另外，在特定环境下还可能有其他基因控制油酸含量。Song［62］在拟南芥中发现在低温下，有一个控制生育酚相关的基因sve1是FAD2的等位基因，在一定的低温条件下，通过抑制sve1，能显著提高油酸含量。因此是否还有像这样的基因调节油酸的生成是一个值得思考的问题。这说明考虑脂肪酸合成途径还应重视与其它生化反应的关联和调控，从而取得更加深入的进展。

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