苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾消化酶活性的影响

骆 颖，张茂新，凌 冰

(华南农业大学昆虫生态研究室，广州 510642)

苦瓜Momordica charantia别名凉瓜、锦荔枝、赖葡萄，为葫芦科苦瓜属一年生草本植物，作为一种蔬菜作物广泛种植于非洲和亚洲，具有抗糖尿病，抑菌等功效 (Grover and Yadav，2004;Beloin et al.，2005;Maurya，2009)。与其他葫芦科作物相比，在其生长发育过程中很少被植食性昆虫为害 (Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000)，表现出较强的抗虫性 (Kumar et al.，1979;Mishraetal，2006)。大量的研究结果表明，苦瓜叶片提取物对多种害虫有明显的拒食、忌避产卵和抑制生长发育的作用，并从中分离鉴定出多种对昆虫有生物活性的苦瓜素类化合物，如Momordicin I、II、Ⅳ和 3β，7β，25-三羟葫芦烷-5，23二烯-19-醛-3-O-β-D-吡喃葡糖苷等，这些化合物是一类葫芦烷型四环三萜类植物次生物质，对昆虫的作用方式主要是拒食、忌避产卵和抑制生长发育 (Chandravadana et al.，1983;陈宏等，1996;李绍勤等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;凌冰等，2008，2009;向亚林等，2009)。

我们前期的研究结果表明，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对小菜蛾幼虫有明显的拒食和抑制生长发育活性 (凌冰等，2008;向亚林等，2009)，对美洲斑潜蝇成虫的拒食和产卵忌避作用显著 (凌冰等，2009)，对黄曲条跳甲也有明显的拒食作用(杨舒媚等，2010)。骆颖等 (另文发表)测定了苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾实验种群增长的抑制作用，发现苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫的生长发育也有明显的抑制作用。为了研究苦瓜叶乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II对斜纹夜蛾的作用机理，我们测定了苦瓜叶片乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶和蛋白酶活性的影响，旨在探索苦瓜植株的抗虫机理，为寻找新的昆虫拒食活性物质，为合理利用苦瓜资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫

斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)由华南农业大学资源环境学院昆虫生态研究室在人工气候室内 ［T:(27±1)℃;RH:70% ～80%;L∶D=14∶10］用人工饲料饲养的种群。斜纹夜蛾人工饲料参照陈其津等 (2000)的方法配制。

1.1.2 供试药品

苦瓜叶乙酸乙酯萃取物及其活性化合物Momordicin II均由本课题组提供。其他试剂均为市售的化学纯试剂，水由SZ－93自动双重纯水蒸馏器制备 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物和Momordicin II混合饲料的配制

用丙酮分别配置不同浓度的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物和Momordicin II药液。将配制好的尚未凝固的人工饲料分别定量地放入保鲜盒内，按饲料:药液等于5∶1的比例，将药液加入人工饲料中，以丙酮作对照。待各浓度的含药混合饲料中的溶剂自然挥发并凝固后，放入冰箱保存备用。

1.2.2 试虫处理及酶液的制备

将大小一致的头一天蜕皮成4龄的斜纹夜蛾幼虫饥饿4 h后，以不同浓度苦瓜叶乙酸乙酯萃取物和Momordicin II配制的人工饲料喂养斜纹夜蛾4龄幼虫，于处理后24 h、48 h和72 h，每处理挑取大小一致的试虫在冰浴下迅速解剖出中肠，去围食膜及食物残渣，将整个中肠转移到5 mL的组织匀浆器中，加4 mL 0.02 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液，充分研磨后在4℃、4000 r/min条件下离心10 min，取上清液作酶液。

1.2.3 淀粉酶活性的测定

参考毕明娟等 (2010)的方法并略加改进。取A、B两支试管，在A管中加入0.2 mL酶液和0.8 mL 1%淀粉溶液作为底物，37℃水浴保温15 min，再加入3，5－二硝基水杨酸试剂1.0 mL，沸水浴5 min，用蒸馏水定容至5 mL，然后用UV300紫外分光光度计 (美国热电公司)测定其在波长520 nm处的吸光值。B管中加入0.8 mL磷酸缓冲液代替酶液，其余操作同A管。试验重复3次。根据A、B管吸光值差计算比活力，以每分钟每毫克蛋白催化水解生成1 mg麦芽糖为1个单位 (U)。

1.2.4 蛋白酶活性的测定

参考潘科等 (2010)的酪蛋白水解比色方法。取A、B两支试管，在A管中先加入酶液1 mL，再加0.5%酪蛋白溶液2.0 mL，37℃水浴保温15 min后加入3 mL 10%三氯乙酸终止反应，以4000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL，按标准曲线制作方法测定其在波长680 nm处的吸光值。B管中加入1.0 mL磷酸缓冲液代替酶液，其余操作同A管，试验重复3次。根据A、B管吸光值差计算比活力，以每分钟每毫克蛋白催化水解生成1 μg酪氨酸为1个单位 (U)。

1.2.5 蛋白质含量的测定

采用Bradford(1976)的考马斯亮蓝比色法。

1.3 数据分析方法

本文中，所有数据均以“平均数±标准误”表示，方差分析采用邓肯氏新复极差检验法(Duncan's multiple range test，DMRT)。数据分析采用SAS system 9.0版软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫中肠消化酶活性的影响

2.1.1 对淀粉酶活性的影响

以含有0.04%和0.08%浓度的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的人工饲料喂养斜纹夜蛾4龄幼虫，24 h、48 h和72 h后对中肠淀粉酶活力的影响见图1。由图1可以看出，0.04%和0.08%2个浓度处理后24 h和48 h，斜纹夜蛾幼虫中肠的淀粉酶活性与对照相比差异不显著，但72 h后，各处理的淀粉酶活性明显降低，0.04%和0.08%浓度的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物处理对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性的抑制率分别为22.7%和23.0%。

图1 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性的影响Fig.1 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

2.1.2 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫蛋白酶活性的影响

以含有0.04%和0.08%浓度的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的人工饲料喂养斜纹夜蛾4龄幼虫，24 h、48 h和72 h后对中肠蛋白酶酶活力的影响见图2。由图2可以看出，0.08%浓度处理24 h后，斜纹夜蛾幼虫中肠的蛋白酶活性就明显低于对照组，抑制率达50.9%;48 h和72 h后，抑制率分别为38.4%和40.6%。0.04%浓度处理在24 h后对蛋白酶活性的影响与对照相比差异不显著，但48 h和72 h后，对蛋白酶活性的抑制作用明显增强，抑制率达38.9%和39.3%。说明苦瓜叶乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫中肠的蛋白酶活性有明显的影响。从上述结果可以看出，苦瓜叶乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的抑制作用大于对淀粉酶活性的抑制作用。

图2 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的影响Fig.2 Effect of ethyl acetate extracts from Momordica charantia leaves on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

2.2 Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠消化酶活性的影响

2.2.1 Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性的影响

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%浓度的Momordicin II的人工饲料喂养斜纹夜蛾4龄幼虫，24 h、48 h和72 h后对中肠淀粉酶活力的影响见图3。由图3可以看出，各浓度Momordicin II处理24 h、48 h和72 h后，斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶的活性与对照相比虽然有所降低但差异不显著，表明Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠的淀粉酶活性无明显的抑制作用。

2.2.2 Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的影响

以含有 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%浓度的Momordicin II的人工饲料喂养斜纹夜蛾4龄幼虫，24 h、48 h和72 h后对中肠蛋白酶活力的影响见图4。由图4可以看出，MomordicinⅡ对斜纹夜幼虫中肠的蛋白酶活力有明显的影响，且随着使用浓度的增加抑制作用也随着增强。MomordicinⅡ处理24 h和48 h后，0.05%和0.10%浓度处理的蛋白酶活性与对照差异不显著，而浓度为0.2%、0.4%和0.6%的Momordicin II处理24 h和48 h后，其蛋白酶活性均显著低于对照，24h的抑制率分别为44.9%、53.1%和63.5%;48 h的抑制率分别为27.0%、31.9%和42.9%。处理72 h后，5个浓度处理蛋白酶活性均显著低于对照，对蛋白酶活性抑制作用最强，各浓度处理的抑制率分别为 43.1%、40.2%、67.4%、71.8%和75.6%。说明Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠的蛋白酶活性有显著的抑制作用。

图3 Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性的影响Fig.3 Effect of Momordicin II on activities of amylase activities of larvae of Spodoptera litura

图4 Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的影响Fig.4 Effect of Momordicin II on activities of protease activities of larvae of Spodoptera litura

3 结论与讨论

本试验研究结果表明苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性和蛋白酶活性均有一定的抑制作用，且对蛋白酶活性的抑制作用更明显。斜纹夜蛾幼虫取食了含有Momordicin II的人工饲料后，对蛋白酶活性的影响与苦瓜叶乙酸乙酯萃取物大体相同，但Momordicin II对淀粉酶活性的影响不明显，说明苦瓜叶乙酸乙酯萃取物中还存在抑制斜纹夜蛾幼虫中肠淀粉酶活性的其他活性物质。

近年来，大量的研究结果表明，苦瓜叶片萃取物及其次生化合物对多种害虫有明显的拒食、忌避产卵和抑制生长发育的作用 (Chandravadana et al.，1983，1987;陈宏等，1996;Yasui，1998;Abe etal.，2000;李 绍勤 等，2001;Boeke，2004;Mekuria et al.，2005，2006;Kashiwagi et al.，2007;任立云等，2008;凌冰等，2008，2009;向亚林等，2009)。目前已从苦瓜叶片提取物中分离鉴定出多种对昆虫有生物活性的苦瓜素类化合物，它们是苦瓜抗虫的重要活性物质，但有关这些化合物对昆虫的作用机理研究尚未见报道。

MomordicinⅡ是苦瓜叶提取物中的最主要苦瓜素类化合物，生物活性测定结果表明MomordicinⅡ具有拒食作用，拒产卵作用和抑制生长发育的作用 (Yasui，1998;Mekuria et al.，2005;凌冰等，2008)。与楝科植物中的印楝素相同，均为四环三萜类化合物。印楝素对多种害虫有拒食、触杀、胃毒、抑制生长发育和影响卵巢发育的作用(Schmutterer，1990)，通过影响口器上厌食及其他化学感器产生初生拒食反应;通过抑制昆虫中肠酯酶和脂肪体中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶和葡萄糖酶的活性，降低昆虫的取食率和对食物的转化利用率形成次生拒食反应 (程东美等2007)。消化酶是由昆虫中肠上皮细胞形成和分泌的，其活性直接影响昆虫对食物中营养物质的消化、吸收。其中，淀粉酶和蛋白酶是昆虫最主要的消化酶。苦瓜叶乙酸乙酯萃取物和Momordicin II对斜纹夜蛾幼虫生长发育及存活的影响可能与其抑制了幼虫中肠内的消化酶有关，淀粉酶和蛋白酶活性的显著降低直接影响了斜纹夜蛾幼虫对食物中淀粉、纤维素及蛋白质等的消化和吸收，进一步抑制了斜纹夜蛾幼虫对食物的摄取及维持其生理功能和生长发育需要的营养物质的吸收，因而影响了斜纹夜蛾的正常生长发育。

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